犬CTLA-4胞外區(qū)編碼序列的克隆、表達與免疫佐劑作用的初步研究.pdf

1、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)是活化的T淋巴細胞表面的一種與免疫信號傳遞有關的膜蛋白分子，由特征性的IgV胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)三部分構成。CTLA-4能與CD28分子競爭結合B7分子，從而抑制T細胞活化，因此完整CTLA-4分子對免疫應答起負調節(jié)作用。單獨的Igv胞外區(qū)雖能與B7分子結合，但不具有免疫負調節(jié)，而能促進抗原提呈細胞(APC)對靶抗原的加工提呈，有可能成為一種新型的分子免疫佐劑。 本研究首先從犬外周血

2、分離淋巴細胞，經CortA刺激活化后提取總RNA，然后用RT-PCR擴增出大約400bp的IgV胞外區(qū)序列，將其克隆入T載體后進行測序，結果顯示其核苷酸序列與已發(fā)表的CTLA-4全基因序列的胞外區(qū)同源性達到99.2％，在氨基酸水平同源性為98.4％，與B7分子結合的六肽基序(MYPPPY)沒有變化。然后將目的片段亞克隆入原核表達載體pQE-31中，在大腸桿菌中成功表達了約17KDa的重組蛋白，并用親和層析進行了純化。 為了研究犬

3、CTLA-4胞外區(qū)的分子免疫佐劑作用，參考文獻報道的方法，用DNAStar軟件包中的Protean程序對犬細小病毒(CPV)VP2蛋白進行親水性和免疫原性分析，選擇親水性和抗原指數高的293-520位氨基酸區(qū)域(命名為VP2S)，利用PrimerPremier5.0軟件設計一對引物，以含CPVVP2基因的重組質粒為模板，擴增出預期大小的VP2S片段，將其分別定向克隆入原核表達載體pQE-31和pQE-31-CTLA4，構建成重組表達質粒

4、pQE-31-VP2S和pQE-31-CTLA4-VP2S。結果在大腸桿菌中成功表達了約29KDa的VP2S和42KDa的CTLA4-VP2S，Westem-blotting結果顯示，兩種重組蛋白能被CPV抗血清識別，證明目的蛋白的表達正確。用親和層析分別對VP2S和CTLA4-VP2S進行純化，以純化的蛋白質免疫小鼠，用間接ELISA測定兩種抗原免疫小鼠血清中的抗體水平，結果CTLA-4-VP2S免疫組的抗體產生時間及抗體滴度高峰出現