人結直腸癌細胞中Kiss-1基因信號通路的初步探索——MAPK、NF-κB信號通路的研究.pdf

1、目的：
　　1、探討Kiss-1基因過表達對結直腸癌細胞增殖能力、侵襲和遷移能力的影響。
　　2、探討Kiss-1基因在結直腸癌細胞中的相關信號傳導通路。
　　3、分析Kiss-1基因抑制結直腸癌轉移能力的可能相關機制。
　　方法：
　　1、應用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR）方法從結直腸癌細胞株SW480、SW620、HCT116、HT-29、LOVO中篩選出Ki

2、ss-1基因 mRNA的表達水平均相對較低者，備用。
　　2、通過構建攜帶Kiss-1基因的慢病毒載體，并感染Kiss-1基因相對低表達細胞株，使其成為穩(wěn)定過表達細胞株，并將原株細胞、空載體細胞、Kiss-1基因穩(wěn)定過表達細胞株分別分為：空白對照組（CON組）、陰性對照組（NC組）、過表達組（OE組）。
　　3、采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）和Transwell小室法分別檢測Kiss-1基因轉染前后

3、細胞的增殖能力、侵襲及遷移能力的變化。
　　4、應用Western-blot法檢測三組細胞中MAPK信號通路的關鍵分子—絲裂原細胞外激酶（mitogen extracellular kiase，MEK）表達含量的變化以及下游效應蛋白肌球蛋白輕鏈（myosinregulatory light chain，MLC）磷酸化水平的變化。
　　5、應用Western-blot法檢測三組細胞中NF-κB信號通路中抑制性蛋白I-κB以及下

4、游效應蛋白基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表達含量的變化。
　　結果：
　　1、在SW480、SW620、HCT116、HT-29、LOVO人結直腸癌細胞株中，經(jīng)qRT-PCR結果顯示，在此5株結直腸癌細胞株中Kiss-1基因表達豐度均為中，但是Kiss-1基因在HCT116細胞株中表達量相對較少（P<0.01）有統(tǒng)計學意義。
　　2、HCT116細胞通過慢病毒轉染

5、之后，報告基因增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)能夠穩(wěn)定表達，熒光率均>80％，Kiss-1基因轉錄產(chǎn)物mRNA及其蛋白 Metastin的表達水平均明顯升高，均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3、Kiss-1基因轉染成功過表達后（OE組），CCK-8法檢測，顯示細胞增殖能力明顯下降，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Transwell小室結果表明，細胞的侵襲及遷

6、移能力亦明顯下降，均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4、Western blot檢測結果顯示，OE組細胞MEK表達含量下降，MLC的磷酸化水平亦明顯下降，與 CON組 NC組之間均有明顯差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5、Western blot檢測結果顯示，OE組細胞抑制性蛋白I-κB的表達含量明顯升高，而MMP-9的表達含量卻明顯降低，與CON組NC組之間均有明顯差異，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

7、r>　　結論：
　　1、Kiss-1基因轉染人結直腸癌HCT116細胞后能夠穩(wěn)定過表達，并且能夠明顯抑制細胞的增殖能力、侵襲和遷移能力。
　　2、Kiss-1基因抑制結直腸腫瘤的增殖能力、侵襲和遷移能力與MAPK信號傳導通路相關，可能通過下調(diào)下游蛋白MLC的磷酸化水平而發(fā)揮作用。
　　3、Kiss-1基因抑制結直腸腫瘤的增殖能力、侵襲和遷移能力與NF-κB信號傳導通路相關，可能通過下調(diào)下游蛋白MMP-9的表達而發(fā)揮作用