Anxall調控小鼠肝癌Hca-P細胞惡性行為及分子機制研究.pdf

1、背景:肝癌細胞淋巴道轉移和耐藥性是影響肝癌患者預后和生存的重要因素，其相應機制的研究可為其臨床診斷和治療提供依據(jù)。膜聯(lián)蛋白A11(AnnexinA11，Anxa11)為膜聯(lián)蛋白家族成員之一，是Ca2+依賴性磷脂結合蛋白。研究表明Anxa11表達失調與腫瘤的惡性轉變、耐藥性及轉移等密切相關，但具體作用機制不清。本課題組前期采用Western blot對來源于同一親本、遺傳背景相同但淋巴道轉移潛能顯著不同的小鼠肝癌腹水型細胞株Hca-P（淋

2、巴結轉移率約25％）和Hca-F（淋巴結轉移率約75％）的研究發(fā)現(xiàn)，Anxa11在Hca-P的表達約為其在Hca-F中的2倍(P＜0.01)，提示Anxa11可能是潛在的抑制小鼠肝癌淋巴道轉移的蛋白。
　　目的:1、構建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11表達載體，穩(wěn)定轉染至Hca-P，篩選獲得Anxa11表達穩(wěn)定下調的Hca-P單克隆細胞株;2、研究Anxa11下調對Hca-P體外凋亡、遷移、侵襲、粘附及耐藥性的

3、影響;3、探究Anxa11下調對Hca-P體內淋巴結轉移能力的影響;4、探討Anxa11下調對Hca-P中轉錄分子c-Jun蛋白以及其磷酸化水平在藥物作用前后的變化。
　　方法:1、按Anxa11的mRNA序列，設計Anxa11的shRNAs以及無關序列作為陰性對照;2、構建含干擾序列的pGPU6/GFP/Neo表達載體，利用限制性內切酶酶切鑒定和序列測定驗證構建載體的正確性;3、利用梭華-Sofast轉染試劑，將構建好的pGPU

4、6/GFP/Neo-shRNA-Anxa11表達載體及無關序列表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA-negative control分別轉染至Hca-P細胞，采用G418篩選及有限稀釋法獲得相應的單克隆細胞株，采用實時定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot檢測Anxa11表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株;4、Transwell小室法和淋巴結原位雜交法檢測Anxa11下調對Hca-P細胞體外遷移、侵襲和粘附能力的影響;5

5、、小鼠足墊皮下注射法分析Anxa11下調后Hca-P細胞淋巴結轉移情況;6、Westernblot分析Anxa11下調對Hca-P中相關凋亡分子表達影響;7、CCK-8法及Hoechst33258試劑盒檢測Anxa11下調對Hca-P細胞耐藥性及抗5-FU誘導凋亡的影響;8、Western blot檢測Anxa11下調對Hca-P細胞在不同濃度5-FU作用后c-Jun的表達變化和磷酸化水平。
　　結果:1、pGPU6/GFP/Ne

6、o-shRNA-Anxa11和negative control表達載體構建成功;2、篩選獲得Anxa11表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株P-1，與無關序列單克隆細胞株P-nc相比，Anxa11在mRNA和蛋白水平分別下調82.49％和80.53％;3、相比P-nc細胞，P-1細胞的體外遷移、侵襲和淋巴結粘附能力分別提高了約1.55、1.20和1.13(1.35)倍;4、P-1細胞體內淋巴結轉移能力明顯高于P-nc細胞;5、Anxa11下調對H

7、ca-P細胞凋亡沒有顯著性影響，但促進Hca-P細胞中Bax和Bcl-2表達;6、與P-nc細胞比較，P-1細胞對5-氟尿嘧啶(5-FU)有明顯的耐藥性，但對順鉑(cisplatin)并沒有產生明顯的耐藥性;7、無5-FU作用下，與P-nc細胞比較，P-1細胞中pSer73-c-Jun磷酸化水平升高，而c-Jun蛋白及pSer73-c-Jun磷酸化水平上調為5-FU劑量依賴性。
　　結論:1、成功構建了pGPU6/GFP/Neo-

8、shRNA-1、2和negative control重組表達載體;2、篩選獲得Anxa11表達穩(wěn)定下調的單克隆細胞株;3、Anxa11下調促進Hca-P細胞的體外遷移、侵襲和淋巴結粘附能力;4、Anxa11下調促進Hca-P細胞體內淋巴結轉移能力;5、Anxa11下調促進Hca-P細胞中Bax和Bcl-2的表達;6、Anxa11下調增強Hca-P細胞對5-FU的耐藥性;6、Anxa11下調可通過影響c-Jun表達及其磷酸化形式來調控鼠肝