胰腺癌與慢性胰腺炎的胰液差異蛋白組學研究.pdf

1、胰腺癌是一種惡性度高，手術切除率低，進展迅速，預后差的消化系統惡性腫瘤，5年生存率不足5％，通常診斷明確時已發(fā)生轉移。據2002年WHO統計，世界上每年有胰腺癌新發(fā)病例約20萬人，占全部惡性腫瘤新發(fā)病的2.1%，每年死亡人數約19.6萬人，占全部惡性腫瘤死亡率的3.4%，占惡性腫瘤死亡率的第8位。在我國目前胰腺癌的發(fā)病率也呈逐年增高趨勢。由于胰腺癌對放、化療不敏感，早期診斷并行腫瘤根治手術是是提高患者生存率的唯一有效的方法。但目前胰腺癌

2、早期診斷水平差，目前胰腺癌的常用的臨床診斷標志物是CA19-9，但是在一些良性膽道、胰腺疾病中CA19-9也會升高，例如急、慢性胰腺炎，肝炎和膽道梗阻等，其對胰腺癌診斷的敏感性和特異性分別為93.1%和78.3%，不能令人滿意。而影像學檢查發(fā)現異常時通常已到了疾病中晚期，失去了早期手術的時機，因此探尋更敏感的早期胰腺癌的特異性標志物是臨床研究的一個迫切需求，另外胰腺癌與慢性胰腺炎的臨床關系尚不明確，胰腺炎的支架治療對臨床癥狀的改善有較多

3、研究，但支架治療在蛋白質水平上對胰腺病理/組織學的改善指標目前未見相關研究。
　　 蛋白質是生命活動的具體執(zhí)行者和體現者，因此深入研究胰腺癌的發(fā)病機制，尋找特異、靈敏的標志物用于早期診斷，客觀上要求在蛋白質組的水平進行進一步探索，近年來開展的表面加強激光解吸電離－飛行時間質譜(SurfaceEnhancedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry，SELDI

4、-TOF-MS)技術為這一探索提供了優(yōu)良的技術平臺。SELDI-TOF-MS技術由蛋白質芯片系統和質譜儀組成，尤其適用于低豐度蛋白質或多肽的檢測。這一方法最大的優(yōu)勢在于高通量、高靈敏度的實現了質譜技術對臨床樣本的直接檢測。SELDI-TOF-MS技術問世后被認為是最有前景的腫瘤早期檢測技術。另外該技術在其他疾病，如心臟病、腎移植、艾滋病、阿爾茨海默病等也陸續(xù)有相關應用研究的報道。
　　 本課題旨在應用SELDI蛋白質指紋圖譜和生

5、物信息學技術從胰液中篩選胰腺癌蛋白質腫瘤標志物并構建檢測模型(pattern)；建立組織蛋白質指紋圖譜的檢測方法從而尋找胰腺癌與慢性胰腺炎胰液間的差異表達蛋白質；并進一步分析慢性胰腺炎胰管支架治療前后胰液蛋白組學的差異。以期找到適合胰腺癌早期診斷的候選腫瘤標志物，為探索胰腺癌發(fā)病機制提供新思路。
　　 第一部分，胰液蛋白質指紋圖譜在胰腺癌中的研究
　　 目的：
　　 通過SELDI-TOF-MS技術研究胰腺癌與慢

6、性胰腺炎患者的胰液蛋白質組學差異，尋找可早期診斷胰腺癌的蛋白質標志物。
　　 方法：
　　 1.ERCP胰管插管抽取胰腺癌與慢性胰腺炎的胰液，預處理標本
　　 2.將蛋白芯片與胰液樣本預處理后結合、沖洗，加能量吸收分子(EAM)，設置SELDI質譜儀參數，質譜檢測及數據處理
　　 結果：
　　 1.檢測胰腺癌胰液樣本6例，慢性胰腺炎組胰液樣本8例，Non-parametric(WilcoxsonT

7、test)檢驗篩查p值小于0.05的差異蛋白質。
　　 2.共檢測到402個經過信噪比和強調過濾的高質量質譜蛋白質峰，發(fā)現有20個蛋白質峰含量有統計學差異(P<0.05)。其中1944.039m/z，1263.395m/z，1231.336m/z，3140.118m/z，1244.721m/z，4354.719m/z，1224.074m/z，4252.905m/z，7922.402m/z，2359.206m/z，1875.959

8、m/z，1438.699m/z，4557.361m/z，2090.424m/z，3864.683m/z，1867.903m/z等16個蛋白質峰在胰腺癌中明顯高于慢性胰腺炎組，而2003.693m/z，3652.22m/z，1982.035m/z，13209.86m/z等4個蛋白質峰在慢性胰腺炎組高于胰腺癌組。
　　 3.t檢驗、Mann-Whitney秩和檢驗初步篩選出了3個單獨區(qū)分兩組能力最強的蛋白質峰m/z1231.336，

9、m/z2090.424，m/z7922.402，經過計算篩選出最佳組合是：m/z1231.336，m/z2090.424，即由這2個蛋白質峰構建的模型可達到最佳檢測效果。測試集盲法驗證的總準確率為100%、靈敏度100%、特異度100%
　　 4.生物信息學查詢鑒定了多種差異蛋白質，其中神經肽、CD24、tRNA甲基轉移酶等在胰腺癌和慢性胰腺炎胰液中有顯著差異。
　　 結論：
　　 1.找到了胰腺癌和慢性胰腺炎胰

10、液的20個差異蛋白質峰，其中m/z1231.336，m/z2090.424，m/z7922.402三個蛋白質峰的差異最顯著
　　 2.m/z1231.336，m/z2090.424兩個蛋白質峰組合所構建的模型能達到鑒別胰腺癌和慢性胰腺炎的最佳檢測效果，總準確率100%
　　 3.CD24、tRNA甲基轉移酶在胰腺癌胰液中顯著高于慢性胰腺炎，揭示了二者可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中重要作用
　　 4.SELDI-TOF-

11、MS技術的特異性及敏感性高，其結果對進一步研究胰腺癌的蛋白質組學改變及其臨床診斷應用具有重要意義
　　 第二部分，慢性胰腺炎支架治療前后胰液蛋白質指紋圖譜研究
　　 目的：
　　 通過SELDI-TOF-MS技術研究慢性胰腺炎患者胰管支架治療前后的胰液蛋白質組學差異。
　　 方法：
　　 1.ERCP胰管插管抽取慢性胰腺炎患者植入胰管支架治療前后的胰液，預處理標本
　　 2.將蛋白芯片與胰

12、液樣本預處理后結合、沖洗，加能量吸收分子(EAM)，設置SELDI質譜儀參數及數據處理
　　 結果：
　　 1.檢測胰慢性胰腺炎組胰液內鏡治療前樣本8例，內鏡植入支架后胰液樣本8例，Non-parametric(WilcoxsonTtest)檢驗篩查p值小于0.05的差異蛋白質。
　　 2.共檢測到471個經過信噪比和強調過濾的高質量質譜蛋白質峰，發(fā)現有18個蛋白質峰含量有統計學顯著性差異(P<0.01)，建立S

13、VM判別模型，區(qū)分陽性組和陰性組的準確率為100%。其中941.1204m/z，1015.591m/z，2007.972m/z，2569.366m/z，2041.688m/z，2021.02m/z，5298.32m/z7個蛋白質峰在治療前明顯高于支架治療后，而5179.94m/z，5816.584m/z，5412.789m/z，2569.366m/z，1930.04m/z，4140.885m/z，6901.154m/z，10518，64

14、m/z，6510.874m/z，7183.722m/z，5951.249m/z11個蛋白質峰在支架治療后明顯高于治療前。
　　 3.生物信息學查詢鑒定了多種差異蛋白質，其中uPA、PYY、MT等在慢性胰腺炎支架治療后的胰液中較治療前明顯升高
　　 結論：
　　 1.慢性胰腺炎支架治療后存在胰液蛋白質組學改變，發(fā)現了18個差異顯著的蛋白質峰
　　 2.uPA、PYY、MT可能是慢性胰腺炎治療后反映其病理生理