糞類圓線蟲(chóng)RIO3蛋白激酶基因克隆、表達(dá)及分布特征的研究.pdf

1、蛋白激酶是一類重要的酶，調(diào)控大量的細(xì)胞過(guò)程包括細(xì)胞周期的前進(jìn)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及代謝。根據(jù)其結(jié)構(gòu)分類，蛋白激酶分為典型蛋白激酶和非典型蛋白激酶。RIO激酶家族屬于非典型蛋白激酶。該家族有三個(gè)成員RIO1、RIO2和RIO3，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白家族。RIO1、RIO2激酶存在于從古細(xì)菌到人類的組織中，且具有組織特異性，這表明RIO激酶在細(xì)胞中具有最基本的作用。對(duì)酵母RIO1、RIO2蛋白激酶的研究表明：RIO1、RIO2激酶

2、在核糖體生物學(xué)中有重要作用，是細(xì)胞進(jìn)入S2細(xì)胞周期及完成有絲分裂的必要因素。人類腫瘤組織中RIO1mRNA與鄰近的正常組織相比，過(guò)量表達(dá)，且呈現(xiàn)出不同的組織分布。人類RIO2是40S核糖體亞基前體成熟的必需因子，也是polo樣蛋白激酶的受體蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂。人類RIO3蛋白僅存在于多細(xì)胞生物的細(xì)胞質(zhì)中，不影響細(xì)胞周期，能夠抑制CASP10激活NFκB通路的活性。人類RIO3基因的上調(diào)，促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的增殖與擴(kuò)散。
　　

3、在營(yíng)自由生活的線蟲(chóng)-秀麗新桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)的研究中，高通量RNAi篩選實(shí)驗(yàn)表明：RIO1及RIO2的敲除影響幼蟲(chóng)的發(fā)育，導(dǎo)致幼蟲(chóng)停止發(fā)育、幼蟲(chóng)死亡以及胚胎死亡，暗示了這個(gè)基因是控制線蟲(chóng)發(fā)育的決定因素之一。盡管這個(gè)基因如此重要，到目前為止，在寄生性線蟲(chóng)中，僅有透明毛圓線蟲(chóng)RIO1及捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)RIO1、RIO2、RIO3的基因結(jié)構(gòu)報(bào)道，無(wú)任何其它寄生線蟲(chóng)相關(guān)功能的報(bào)道。為此，本課題主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)

4、行了研究：
　　 1)糞類圓線蟲(chóng)RIO3基因的cDNA、gDNA、啟動(dòng)子序列分析
　　 通過(guò)RACE技術(shù)獲得糞類圓線蟲(chóng)(Strongyloides stercoralis)RIO3蛋白激酶的全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)1765bp，預(yù)測(cè)ORF序列長(zhǎng)1521bp，編碼506個(gè)氨基酸，其中5’-UTR為179bp，3’-UTR為65bp。用生物信息學(xué)對(duì)Ss-RIO3-cDNA的序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它與其它物種該基因氨基酸序列的同源

5、性在22.5%-37.4%之間，且含有RIO激酶的保守功能區(qū)域。用鄰接法構(gòu)建RIO3氨基酸進(jìn)化樹(shù)，選擇了19個(gè)物種做參考，其中包括6個(gè)種類的線蟲(chóng)，6種線蟲(chóng)分支形成一簇，其中包括糞類圓線蟲(chóng)。通過(guò)長(zhǎng)PCR技術(shù)獲得了糞類圓線蟲(chóng)RIO3的gDNA序列，經(jīng)與cDNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)RIO3基因沒(méi)有內(nèi)含子。而其它兩個(gè)線蟲(chóng)(捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、秀麗新桿線蟲(chóng))該基因均含有內(nèi)含子，說(shuō)明糞類圓線蟲(chóng)的該基因具有其特異性。通過(guò)Genome Walking技術(shù)獲得RI

6、O3基因的啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)為600bp。啟動(dòng)子元件分子表明：RIO3啟動(dòng)子序列含有4個(gè)TATAbox(TATAWAW)，4個(gè)GATAmotif(WGATAR)，2個(gè)InverseGATA(TTATC)。
　　 2)RIO3基因在糞類圓線蟲(chóng)各發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平
　　 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)，研究各階段(寄生性成蟲(chóng)pAD，寄生性一期幼蟲(chóng)ppL1，自由生活的一期幼蟲(chóng)pfL1，自由生活的三期幼蟲(chóng)iL3，自由生活的成蟲(chóng)

7、FAD)蟲(chóng)體該基因的轉(zhuǎn)錄水平。研究結(jié)果表明：該基因在各發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄，其中感染期三期幼蟲(chóng)和自由生活的成蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄水平較高。
　　 3)體外原核表達(dá)糞類圓線蟲(chóng)RIO3激酶蛋白并檢測(cè)其激酶活性
　　 構(gòu)建原核表達(dá)載體，體外微量表達(dá)了該蛋白。截取RIO3cDNA序列從499bp到1419bp的片段，體外原核表達(dá)了該截短序列。進(jìn)一步酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該表達(dá)截短蛋白不能自磷酸化及磷酸化MBP蛋白，說(shuō)明該截短蛋白不具有自磷酸化活性及磷酸

8、化MBP蛋白的功能，有待進(jìn)一步研究。
　　 4)糞類圓線蟲(chóng)RIO3基因啟動(dòng)子在蟲(chóng)體中的定位研究
　　 構(gòu)建綠熒光表達(dá)載體Ss-promoter-PAJ02，通過(guò)性腺顯微注射技術(shù)導(dǎo)入自由生活的雌蟲(chóng)性腺中，觀察自由生活的雌蟲(chóng)、蟲(chóng)卵、L1期幼蟲(chóng)中該基因在蟲(chóng)體中的空間表達(dá)形式，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)該基因在蟲(chóng)體中表達(dá)。
　　 本研究獲得了Ss-RIO3蛋白激酶的cDNA，gDNA及啟動(dòng)子的DNA序列并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基