川芎嗪體外誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)樣細胞.pdf

1、目的:從新生兒臍帶分離并培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞，對其細胞表型進行鑒定;觀察不同濃度川芎嗪在體外誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)樣細胞的作用，初步探討人臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化的機制。
　　方法:取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，剔除臍動脈和臍靜脈，以D-Hank's充分沖洗，將剩余的臍帶間質(zhì)組織切割成1mm3大小的組織塊，0.2％膠原酶Ⅱ消化，在含有20％胎牛血清(FBS)、2 ng/ml表皮細胞生長因子(EGF)、25 mM

2、左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察原代培養(yǎng)細胞的形態(tài)學變化，當細胞達80％～90％融合時，加入0.25％胰酶-1mM EDTA消化細胞，并傳代。
　　收集消化后的細胞，采用流式細胞術(shù)行細胞表型檢測，包括CD73、CD90和CD105、CD19、CD34、CD45、CD11和組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，以抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對

3、照。
　　原代hUMSCs按1∶1的比例傳代后是為P1代，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化，細胞達到90％以上融合時按1∶2或1∶3比例進行傳代，繪制細胞生長曲線。
　　擴增后取第5代細胞，接種于四個六孔細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔加入全培養(yǎng)基2.5mL，培養(yǎng)方法同細胞培養(yǎng)瓶，將四個六孔板隨機分為A、B、C、D四組，待各組培養(yǎng)的細胞融合至70％時，棄去培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌2次，前三組設為含不同濃度川芎嗪誘導液的實驗組，濃度依次為:A

4、組4.67mg/mL、B組2.34 mg/mL、C組1.17 mg/mL，誘導液用不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基配制，D組設為對照組，只含L-DMEM培養(yǎng)基。觀察四組誘導hUMSCs向神經(jīng)樣細胞分化情況，每0.5h倒置相差顯微鏡觀察誘導后細胞形態(tài)的變化，連續(xù)觀察6小時，第6小時用免疫細胞化學染色方法檢測神經(jīng)細胞表面標志神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達情況，并計算陽性細胞率，結(jié)果以(

5、X)±s表示。
　　結(jié)果:原代細胞接種12h后多數(shù)細胞貼壁，細胞最初呈菱形、橢圓形生長，隨培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)量逐漸增多，細胞形態(tài)變?yōu)楦鼮榫坏拈L梭形，當細胞融合至90％時，低倍鏡下細胞排列為放射狀、旋渦狀生長。連續(xù)傳代后仍保持旺盛的增殖能力。
　　流式細胞術(shù)檢測P3、P5和P10代細胞表面分子標記，結(jié)果顯示各代均表達CD73、CD90和CD105，而不表達CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。
　　

6、A組加入誘導液后0.5h可見約40％細胞收縮成橢圓形或球形，并伸出多條細長的突起，1h時神經(jīng)樣細胞的比例可達55％左右，細胞進一步收縮，突起伸長，相鄰細胞突起相互連接成網(wǎng)狀，1.5h可見85％左右的神經(jīng)樣細胞，4h可見部分神經(jīng)樣細胞開始脫落6h神經(jīng)樣細胞比例約80％。B組加入誘導液后1.5h細胞發(fā)生明顯變化，可見45％左右的神經(jīng)樣細胞，至第2h達80％，之后可見零星神經(jīng)樣細胞脫落，至第6h該比例降至70％左右。C組細胞于誘導后4.5h可

7、見30％左右的神經(jīng)樣細胞，但伴隨著細胞的脫落，至第6h該比例為55％左右。對照組細胞形態(tài)誘導前后未見明顯變化。誘導至第6小時，免疫細胞化學檢測顯示實驗組各組神經(jīng)樣細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF-H)表達陽性，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達陰性，A組（4.67mg/mL組）細胞NSE、NF-H陽性表達率最高。對照組誘導前后無明顯變化。
　　結(jié)論:hUCMSCs可以在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代，并保持較高的增殖能力;傳