健康人群淋巴細胞BPDE-DNA加合物的修復差異與ERCC2-XPD基因多態(tài)關聯性的實驗研究.pdf

1、前言:
　　 環(huán)境致癌因子苯并(a)芘(Benzo[a]pyrene,B(a)P)廣泛存在于環(huán)境中,是多環(huán)芳烴類化合物的典型代表。B(a)P在機體內經肝微粒體酶活化系統(tǒng)代謝活化后形成終致癌物二氫二醇環(huán)氧苯(a)芘(Benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide(±),(anti),BPDE),BPDE與DNA結合形成DNA加合物,造成DNA損傷,可誘發(fā)皮膚癌、肺癌、直腸癌、胃癌、膀胱癌等多

2、種癌癥。
　　 癌癥是多基因、多因素參與,多階段發(fā)展的復雜過程,是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結果。在相同的環(huán)境暴露下,只有少數人會發(fā)生腫瘤,說明易感性在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著不可忽視的作用。有資料表明,DNA損傷修復能力的個體差異是決定腫瘤易感性的重要因素,而個體DNA修復能力與DNA修復基因的單核苷酸多態(tài)(Singlenucleotidepolymorphisms,SNP)密切相關。核苷酸切除修復交叉互補基因2(excisio

3、nrepaircrosscomplementationgroup2,ERCC2),又稱為著色性干皮病基因D(xerodermapigmentsumgroupD,XPD),是一種重要的DNA修復基因,它所編碼的ERCC2/XPD蛋白,是TFⅡH復合物的亞單位,是核苷酸切除修復(NucleotideExcisionRepair,NER)中的關鍵因子。在NER途徑中,DNA損傷被特定的蛋白識別后,TFⅡH復合物發(fā)揮其5'→3'DNA解旋酶作用

4、,打開受損位置的DNA雙鏈,使受損DNA被特異性核酸內切酶切除,完成DNA損傷修復。近年來關注較多的ERCC2/XPD基因的SNP有密碼子751(A→C)、312(G→A)和156(C→A)。流行病學研究結果顯示,ERCC2/XPD基因SNP與肺癌、皮膚癌、食管癌、膀胱癌、頭頸癌等多種腫瘤的易感風險密切相關,但結論不盡相同。ERCC2/XPD基因Lys751Gin、Asp312Asn和Arg156Arg位點的基因頻率分布具有明顯種族、地

5、區(qū)差異。因此,健康人群DNA修復能力與ERCC2/XPD基因751、312和156位點SNP的相關分析對中國東北地區(qū)漢族人群篩選腫瘤易感性位點有重要意義,有助于闡明腫瘤發(fā)病機制,估計人群發(fā)病風險,找尋意義確切的腫瘤易感生物標志,對于腫瘤的早期發(fā)現及合理治療具有重要意義。
　　 本研究以沈陽地區(qū)漢族健康人群為研究對象,提取外周血基因組DNA,檢測ERCC2/XPDLys751Gin(rsl3181)、Asp312Asn(rs179

6、9793)和Arg156Arg(rs238406)位點的基因型,同時培養(yǎng)外周血淋巴細胞,用環(huán)境致癌因子B(a)P體外誘導BPDE-DNA加合物的形成,采用高效液相色譜法和改良彗星實驗精確評價個體DNA損傷修復能力,分析ERCC2/XPD不同基因型和單體型對于DNA損傷修復能力的影響,試圖探討環(huán)境致癌因子所致DNA損傷的修復能力的個體差異與ERCC2/XPD基因多態(tài)及其表達的關聯,找尋意義確切的腫瘤關聯性生物標志物,進而試圖闡明基因.基因

7、、基因一環(huán)境間的交互作用及其機制,為NER通路腫瘤關聯性生物標志物的研究提供科學依據。
　　 研究方法:
　　 1、研究對象的確定
　　 自2010年10月至2011年5月,收集沈陽市成年漢族健康人外周血818例,填寫簡單調查問卷并記錄人口學特征、既往病史、家族史及生活方式(吸煙、飲酒)等一般狀況。研究對象排除腫瘤、遺傳性疾病、重度感染等疾病,告知研究對象并簽署知情同意書后實施研究計劃。
　　 2、個體淋

8、巴細胞DNA損傷修復能力的評定
　　 2.1BPDE-DNA加合物水平測定(高效液相色譜法)。
　　 2.2B(a)P所致DNA損傷水平測定(改良彗星實驗)。
　　 3、淋巴細胞DNA修復能力與ERCC2/XPD多態(tài)性關聯性分析
　　 3.1Tris平衡酚-氯仿法于抗凝外周血中提取DNA;Nanodrop儀測量DNA濃度及OD260/OD280比值
　　 3.2TaqMan(R)熒光實時定量PCR

9、法檢測ERCC2/XPDLys751Gln(rs13181),Asp312Asn(rs1799793)和Arg156Arg(rS238406)的基因型
　　 3.3ERCC2/XPDLys751Gln(rsl3181),Asp312Asn(rs1799793)和Arg156Arg(rs238406)基因型在人群中的分布頻率及連鎖不平衡性分析
　　 3.4DNA修復能力與ERCC2/XPD各位點SNP及單體型的關聯分析

10、r>　　 4、BPDE-DNA加合物損傷修復的多因素分析
　　 5、ERCC2/XPD基因表達水平的分析
　　 5.1實時定量PCR檢測BPDE染毒后ERCC2/XPDmRNA表達水平;
　　 5.2分析ERCC2/XPDmRNA水平在Arg156Arg(rs238406)不同基因型間的差異
　　 結果:
　　 1、ERCC2/XPD基因各位點SNP在人群中的分布頻率及連鎖不平衡分析
　　

11、 ERCC2/XPDLys751Gin、Asp312Asn和Arg156Arg基因多態(tài)均符合Hardy-Weinberg平衡定律,P＞0.05;各位點間存在連鎖不平衡:Asp312Asn(rs1799793)與Arg156Arg(rs238406)(D'=1.0,R2=0.059);Lys751Gln(rs13181)與Asp312Asn(rs1799793)(D'=0.503,R2=0.247);Lys751Gln(rs13181)

12、與Arg156Arg(rs238406)(D'=0.779,R2=0.036)
　　 2、BPDE-DNA加合物水平與人群基本特征、ERCC2/XPDSNP及其單體型的關聯性分析
　　 BPDE-DNA加合物水平與年齡和ERCC2/XPDArg156Arg位點的SNP有關,50-69歲和≥70歲年齡組個體的加合物水平顯著高于＜30歲年齡組個體(P＜0.05);攜帶ERCC2/XPDArg156Arg位點AA基因型個體BP

13、DE-DNA加合物水平顯著高于CC基因型攜帶者(P＜0.05);多元線性回歸分析顯示,ERCC2/XPDArg156Arg位點SNP及年齡對BPDE-DNA加合物含量的影響有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),多元線性回歸模型顯示ERCC2/XPDArg156Arg位點SNP對BPDE-DNA加合物的影響程度為0.194,年齡為0.082:單體型分析顯示,含ERCC2/XPDArg156Arg(rs238406)位點A等位基因的個體有較高水平B

14、PDE-DNA加合物(P＜0.05)。
　　 3、改良彗星實驗法檢測B(a)P所致DNA損傷修復能力與人群基本特征及ERCC2/XPD各位點SNP的關聯性分析
　　 DNA損傷修復能力與年齡及ERCC2/XPDArg156Arg位點SNP有關。在50-69歲和≥70歲年齡組個體的彗星尾距比值高于＜30歲年齡組個體,≥70歲年齡組個體的彗星尾部面積比值高于＜30歲年齡組個體(P＜0.05);攜帶ERCC2/XPDArg15

15、6Arg位點AA基因型個體的彗星尾距比值、尾部面積比值均高于CC基因型攜帶者(P＜0.05)。
　　 4、B(a)P所致DNA損傷水平的綜合評分與人群基本特征和ERCC2/XPD各位點SNP的關聯性分析
　　 多元線性回歸分析表明ERCC2/XPDArg156Arg位點SNP和年齡對DNA損傷水平綜合評分的影響有統(tǒng)計學意義,多元線性回歸模型顯示ERCC2/XPDArg156Arg位點SNP對DNA損傷水平綜合評分的影響程

16、度為0.223,年齡的影響程度為0.203。
　　 5、BPDE處理后ERCC2/XPDmRNA表達水平與ERCC2/XPDArg156Arg位點SNP的關聯性分析
　　 BPDE處理后的ERCC2/XPDmRNA表達水平在ERCC2/XPDArg156Arg位點各基因型間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1、ERCC2/XPDArg156Argrs238406位點A等位基因會增加淋巴細胞

17、高水平BPDE-DNA加合物的風險,與個體DNA損傷修復能力降低相關聯。
　　 2、ERCC2/XPDArg156Arg不同基因型的淋巴細胞在經BPDE染毒處理后ERCC2/XPDmRNA的表達水平未見明顯差異,ERCC2/XPDArg156Arg(rs238406)是否可作為意義確切的腫瘤遺傳易感生物標志尚待明確。
　　 3、本研究中BPDE-DNA加合物水平與ERCC2/XPDLys751Gin和Asp312Asn位