IDO基因過表達誘導小鼠肺移植慢性排異免疫耐受的實驗研究.pdf

1、背景：肺移植是目前治療終末期肺病唯一有效方法，術后一年生存率可達71％，但5年生存率低于50%，為目前實體器官移植中最低。影響肺移植患者長期生存的主要原因為移植后的慢性排異，其特征性表現(xiàn)為閉塞性細支氣管炎(Obliterative Bronchiolitis，OB)，而現(xiàn)有的免疫抑制劑常無法逆轉。誘導供體或受體自身免疫抑制或免疫耐受，對預防和治療移植后急慢性排異的發(fā)生，延長移植物存活、提高受體的生活質量都具有重要的意義。IDO（indo

2、leamine2,3-dioxygenase，吲哚胺2,3二加氧酶）為細胞內一種色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶，在誘導自身免疫疾病、母胎免疫耐受、腫瘤免疫逃逸及移植免疫耐受等方面均發(fā)揮重要的調節(jié)作用，被稱為免疫抑制酶。研究發(fā)現(xiàn)，通過基因治療調控IDO的表達可以保護細胞和組織移植物，誘導產生移植后免疫耐受。本課題設計建立小鼠頸部異位氣管移植模型來模擬肺移植慢性排異過程，并構建重組腺病毒IDO基因表達載體轉染供體小鼠氣道上皮，使之高表達

3、IDO，研究移植氣道上皮IDO過表達在減輕閉塞性細支氣管炎，誘導肺移植慢性排異免疫耐受中的作用及可能機制，為今后適用于臨床提供理論依據(jù)。
　　 第一部分Gateway技術構建重組腺病毒IDO基因表達載體
　　 目的：利用Gateway分子克隆技術構建含報告基因EGFP的重組腺病毒IDO基因表達載體，并對經菌落PCR篩選、測序鑒定的重組腺病毒載體進行病毒包裝、純化及滴度測定。
　　 方法：利用Gateway分子克隆

4、技術方案，由重疊PCR先擴增、合成含attB1-kozak-IDO1/IRES/EGFP-attB2目的基因片段，再經BP反應合成pDown-IDO1/IRES/EGFP目的基因入門克隆，最終由LR反應合成pAV.Ex1d-CMV＞IDO1/IRES/EGFP重組腺病毒目的表達載體。將以上經菌落PCR篩選、測序鑒定正確的載體質粒轉染HEK293A包裝細胞擴增，收集、純化含病毒顆粒上清液，采用TCID50法測定病毒滴度。
　　 結

5、果：基因測序鑒定經菌落PCR篩選的pDown-IDO1/IRES/EGFP及pAV.Ex1d-CMV＞IDO1/IRES/EGFP載體質粒，其基因序列與實驗設計IDO基因序列完全一致。導入HEK293A包裝細胞后，可見報告基因EGFP亮綠色熒光蛋白表達。TCID50法測定病毒滴度為3.16×1010PFU/ml。
　　 結論：成功構建含報告基因EGFP的重組腺病毒IDO基因表達載體，導入HEK293A包裝細胞后能產出高滴度的重組

6、腺病毒用于轉基因治療。
　　 第二部分IDO基因轉染小鼠氣道上皮的可行性研究
　　 目的：將攜帶IDO基因的重組腺病毒載體轉染體外培養(yǎng)的小鼠氣道上皮，觀察氣道上皮細胞IDO基因轉染的表達效率及酶活性；同時建立經氣道病毒轉染模型，探討IDO基因活體轉染氣道上皮的可行性。
　　 方法：原代提取、培養(yǎng)小鼠氣道上皮細胞，行IDO基因重組腺病毒轉染，同時設空載體轉染組和空白組對照。熒光顯微鏡下觀測各組氣道上皮細胞生物活性及

7、病毒轉染效率，并經qRT-PCR、Western blot技術檢測上皮細胞IDO mRNA及蛋白表達水平。收集各組培養(yǎng)液上清，采用高效液相色譜法（HPLC）檢測上清液中色氨酸及犬尿氨酸含量以評估氣道上皮細胞中IDO酶活性。建立小鼠經氣道病毒轉染模型，觀察小鼠氣道上皮IDO基因轉染的表達時效及生物安全性。
　　 結果：采用感染復數(shù)MOI=50病毒量體外轉染氣道上皮24h后，其轉染效率可達100%，但熒光較弱，提高MOI值，熒光隨之

8、增強，而細胞狀態(tài)沒有太大的差異。qRT-PCR、Western blot檢測IDO基因轉染后氣道上皮細胞IDO mRNA及蛋白表達水平較空載體組、空白組明顯增高(P＜0.01)。經氣道轉染腺病毒，IDO基因大部分表達于氣道上皮且持續(xù)時間超過3周，無呼吸系統(tǒng)損傷。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，無論培養(yǎng)液上清，還是氣道組織，IDO基因轉染組的IDO活性皆顯著高于空載體組和空白對照組(P＜0.01)。
　　 結論：攜帶IDO基因的腺病毒在體內外皆

9、可穩(wěn)轉氣道上皮過表達IDO基因及蛋白，且具有酶活性。經氣道途徑轉染腺病毒載體，氣道上皮轉染率、安全性高，時效可超過3周。
　　 第三部分IDO基因過表達誘導CD4+T細胞／BMDCs免疫耐受
　　 第一節(jié)IDO基因過表達誘導CD4+T細胞增殖抑制
　　 目的：通過建立小鼠氣道上皮細胞與CD4+T細胞體外共培養(yǎng)體系，探討氣道上皮細胞IDO基因過表達對CD4+T細胞增殖活性、早期凋亡的影響及在上調CD4+CD25+T

10、reg細胞FoxP3表達，誘導免疫耐受中的作用。
　　 方法：分別建立空白組、IDO轉染組、GFP轉染組、1-MT干預組小鼠氣道上皮細胞與磁珠分選、純化的CD4+T細胞共培養(yǎng)體系。經CD3/CD28刺激共培養(yǎng)72h后，采用CCK8法、AnnexinV+ITC與PI雙染法檢測各組CD4+T細胞增殖活性、早期凋亡率。采用混合淋巴細胞反應(MLR)、流式細胞分析檢測各組共培養(yǎng)后CD4+T細胞免疫功能及CD4+CD25+Treg細胞中F

11、oxP3表達變化。采用HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性。
　　 結果：經體外刺激共培養(yǎng)72h后，CCK8法檢測IDO轉染組CD4+T細胞增殖刺激指數(shù)(SI)明顯低于對照組、GFP空載體組(P＜0.01)；當加入IDO特異性抑制1-MT后，增殖指數(shù)明顯升高(P＜0.01)。AnnexinV-FITC與PI雙染法檢測IDO轉染組早期凋亡率明顯高于對照組、GFP轉染組(P＜0.01)，加入1-MT后早期凋亡率下降(P＜0.01

12、)。流式細胞分析CD4+T細胞表型發(fā)現(xiàn)，IDO轉染組Treg細胞FoxP3表達比例顯著高于對照組、GFP空載體組(P＜0.01)；加入1-MT后，F(xiàn)oxP3表達下降(P＜0.01)。MLR檢測各組共培養(yǎng)后CD4+T細胞刺激脾淋巴細胞增殖能力顯示：IDO轉染組脾淋巴細胞增殖抑制率明顯高于對照組、GFP空載體組(P＜0.01)，當加入1-MT處理后，其刺激脾淋巴細胞增殖抑制率下降(P＜0.01)。HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性，其

13、IDO轉染組顯著高于對照組及GFP轉染組(P＜0.01)；加入1-MT后IDO活性下降(P＜0.01)。
　　 結論：共培養(yǎng)體系中，氣道上皮IDO基因過表達能明顯抑制CD4+T細胞活化增殖，誘導其凋亡；并可上調CD4+CD25+Treg細胞表達FoxP3，產生免疫耐受；此種效應為IDO依賴性，可被其阻滯劑1-MT所阻斷。
　　 第二節(jié)IDO基因過表達對BMDCs成熟分化的影響
　　 目的：體外擴增、培養(yǎng)BMDCs

14、細胞，觀察其成熟、表型分化特點。通過建立小鼠氣道上皮細胞與BMDCs刺激共培養(yǎng)體系，探討氣道上皮細胞IDO基因過表達對BMDCs成熟、表型分化的影響及在誘導BMDCs免疫耐受中的作用。
　　 方法：采用rGM-CSF（10ng/ml）、rIL-4（4ng/ml）體外擴增、培養(yǎng)BMDCs，觀察其形態(tài)學及表型成熟分化特點。于培養(yǎng)第7d分別建立與空白組、IDO轉染組、GFP轉染組、1-MT干預組小鼠氣道上皮細胞在LPS（1ug/ml）

15、刺激下共培養(yǎng)體系。72h后，采用流式細胞分析檢測各組BMDCs中MHCII、CD86/80表型分化變化，并由混合淋巴細胞反應(MLR)評價其免疫功能，HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性。
　　 結果：體外擴增、培養(yǎng)BMDCs，7d前為未成熟DCs，經LPS(1ug/ml)刺激培養(yǎng)72h后可分化為成熟DCs。未成熟BMDCs與各組氣道上皮細胞經LPS刺激共培養(yǎng)72h后，IDO轉染組BMDCs表面MHCII、CD80/86分子

16、表達明顯低于對照組、GFP轉染組(P＜0.01)；加入1-MT后DCs細胞表面分子表達增強(P＜0.01)。MLR評價各組共培養(yǎng)后BMDCs刺激脾淋巴細胞增殖能力顯示：IDO組BMDCs刺激脾淋巴細胞增殖率明顯低于對照組、GFP轉染組(P＜0.01)；加入1-MT后，其刺激脾淋巴細胞增殖能力增強(P＜0.01)。HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性，IDO組顯著高于對照組、GFP轉染組(P＜0.01)，加入1-MT后IDO活性下降(

17、P＜0.01)。
　　 結論：共培養(yǎng)體系中，氣道上皮細胞IDO基因過表達可明顯抑制BMDCs表面MHCII、CD80、CD86分子的表達，阻礙其進一步分化成熟，誘導其產生耐受性。且此種效應為IDO依賴性，可被其阻滯劑1-MT所阻斷。
　　 第四部分小鼠異位氣管移植模型模擬肺移植慢性排異
　　 目的：建立小鼠異位氣管移植模型來模擬肺移植后慢性排異特征性表現(xiàn)閉塞性細支氣管炎(OB)的病理過程，為研究肺移植慢性排異提供

18、實驗平臺。
　　 方法：30只小鼠隨機分入實驗組、對照組，每組各15只，分別進行小鼠頸部異位氣管移植。其中實驗組受體為C57BU6(H-2b)近交系小鼠，對照組為BABL/c(H-2d)近交系小鼠，兩組供體氣管皆取自BABL/c近交系小鼠。各組分別于術后7d、14d、28d隨機處死5只受體鼠，取移植氣管進行組織病理學評價、CD3+T細胞免疫組化染色分析、并測定其氣管閉塞程度。
　　 結果：實驗組移植氣道免疫病理損傷隨移植

19、時間延長而加重，28d移植氣道完全閉塞，與臨床閉塞性細支氣管炎的病理過程相似。實驗組病理評分、CD3+T細胞浸潤及氣管閉塞程度顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　 結論：小鼠異位氣管移植模型可模擬肺移植后慢性排異-閉塞性細支氣管炎的免疫病理過程。該模型操作簡單，建模穩(wěn)定，可用于肺移植慢性排異的相關研究。
　　 第五部分IDO基因過表達減輕肺移植慢性排異一閉塞性細支氣管炎的研究
　　 目的：在小鼠異位氣管移植模型

20、基礎上，探討小鼠移植氣道上皮IDO基因過表達在誘導肺移植慢性排異免疫耐受，減輕閉塞性細支氣管炎中的作用及可能的機制。
　　 方法：60只受體C57BU6(H-2b)小鼠隨機平均分入對照組、IDO轉染組、GFP轉染組、1-MT干預組，建立頸部異位氣管移植模型。供體移植氣管皆取自BABL/c(H-2d)小鼠，其中IDO組供體氣管經重組IDO腺病毒轉染，GFP組供體氣管經空載體轉染7d后移植。各組于術后7d、14d、28d隨機處死5只

21、受體鼠，取異位移植氣管進行組織病理學、CD3+T細胞免疫組化檢查，并對IDO組移植氣管進行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植后IDO基因表達情況。建模第7d，取各組移植氣管及旁淋巴結組織，進行組織內T淋巴細胞增殖活性及Th17、Treg細胞流式檢測。實驗末，采用HPLC檢測外周血、移植氣管及旁淋巴組織內IDO活性。
　　 結果：各實驗觀察點IDO組移植氣道免疫病理損傷明顯較其他組為輕，其病理評分、CD3+T細胞浸潤及氣管閉塞程度顯著

22、低于對照組、GFP轉染組、1-MT干預組(P＜0.05)。對IDO組移植氣管進行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察：移植后IDO基因表達可持續(xù)4周。流式細胞檢測移植后7d氣道組織及旁淋巴結T細胞增殖活性，IDO組T細胞增殖率明顯低于其他各組，同時Treg細胞比例增多，Th17細胞比例相應減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。HPLC檢測移植氣道、旁淋巴組織及血漿內IDO活性，IDO組明顯高于其他各組(P＜0.01)；而血漿內各組IDO活性比較