hBax和hHGF雙基因共表達慢病毒的構建及其對血管內皮細胞和成纖維細胞的影響.pdf

1、目的：包裝增強型綠色熒光蛋白標記的表達hBax和hHGF雙基因的慢病毒載體,觀察慢病毒感染后對內皮細胞和成纖維細胞的影響。
　　 方法：通過重疊PCR技術和gatewaytechnology技術構建攜帶目的基因的陽性質粒和儀攜帶綠色熒光蛋白的陰性質粒并測序,上述兩種質粒分別和輔助質粒一同轉染293FT細胞包裝病毒,利用熒光顯微鏡來檢測病毒滴度。本實驗選取人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人胚肺成纖維細胞(HELF)和小鼠胚胎成纖維

2、細胞(NIH3T3細胞)作為研究的目的細胞,利用包裝成功的慢病毒感染目的細胞,根據對目的細胞的處理不同,試驗分為實驗組(感染了攜帶Bax和HGF雙目的基因的慢病毒)、陰性對照組(感染了僅攜帶有綠色熒光蛋白的慢病毒)和空白組(未做任何處理的正常細胞)3組。RT-PCR和Westernblot檢測染毒后各組細胞Bax和HGF的表達情況;在倒置顯微鏡下面觀察3組細胞在形態(tài)學上所發(fā)生的變化;MTT法檢測3組細胞間的增殖能力是否有差異,細胞劃痕法

3、觀察HUVEC染毒后遷移能力的變化。
　　 結果：經鑒定慢病毒載體質粒構建成功,利用熒光顯微鏡測得hBax和hHGF共表達慢病毒和僅表達綠色熒光蛋白的陰性病毒滴度分別為7.8×107TU/ml和9×107TU/ml。RT-PCR和westernblot結果顯示染毒后使HUVEC表達HGF并且上調了Bax基因的表達(P＜0.05)。倒置顯微鏡下可見實驗組細胞變?yōu)殚L梭形或者不規(guī)則的多角形,細胞表面的突起增多;實驗組較之其他兩組細胞,

4、其增殖能力和遷移能力都明顯的提高(P＜0.05)。NIH3T3細胞和HELF染毒后,RT-PCR和westemblot結果顯示實驗組與其他兩組相比,Bax和HGF的表達明顯上調(P＜0.05);倒置顯微鏡下可見陰性對照組的細胞與空白組的細胞生長正常。實驗組細胞在染毒72h后,部分細胞發(fā)生皺縮,體積縮小;96h后可見有部分貼壁細胞脫落;MTT結果顯示實驗組較之其他兩組細胞,感染hBax和hHGF雙基因共表達慢病毒后的上述兩種細胞增殖明顯被