EPAC2下調(diào)通過激活CDK5誘導Tau蛋白過度磷酸化.pdf

1、背景：
　　阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一種常見的、進行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學特征是腦內(nèi)神經(jīng)元細胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結（NFTs）和細胞外的老年斑(SPs)的形成。NFTs的主要成分是過度磷酸化的 Tau。異常磷酸化的Tau喪失促微管組裝和穩(wěn)定微管的功能,并聚集成為成對螺旋絲（PHF），最終導致NFTs的形成、突觸的退變和神經(jīng)元的丟失,在AD的病程發(fā)生、發(fā)展中起了關鍵作用。

2、>　　鳥嘌呤核苷酸交換蛋白（EPAC）作為cAMP直接激活的下游蛋白，在生物進程調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。EPAC1/2敲除小鼠表現(xiàn)出學習記憶和社會交往的障礙，且EPAC2亞型在AD患者腦中mRNA水平表達下降，提示EPAC2下調(diào)參與AD的病程調(diào)節(jié)。然而EPAC2信號如何調(diào)節(jié)體內(nèi)相關通路，從而影響學習記憶尚不清楚。
　　目的：
　　探討EPAC2調(diào)節(jié)的信號通路對Tau蛋白異常過度磷酸化的調(diào)控機制；探究如何逆轉EPAC2下調(diào)后帶來

3、的學習記憶障礙。
　　方法：
　　在探討EPAC2信號通路對Tau蛋白異常過度磷酸化調(diào)控機制的研究中，我們應用了EPAC2-/-轉基因小鼠和si-EPAC2質(zhì)粒，應用免疫印跡實驗在整體水平和細胞水平分別檢測 Tau蛋白磷酸化相關抗體的表達，并分離出可溶性和不可溶蛋白組分對Tau蛋白的溶解性進行探討。為了驗證是否有Tau蛋白過度磷酸化導致的神經(jīng)纖維纏結，我們進行了Bielschowsky銀染。
　　為了探究造成上述結果的

4、機制，我們應用免疫印跡反應篩選了一系列與Tau蛋白磷酸化相關的激酶酯酶，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié) Tau蛋白磷酸化關鍵的激酶 CDK5被激活,再根據(jù)文獻研究找到 CDK5上游因子 Calpain并進行活性檢測。為了解釋 EPAC2下調(diào)與Calpain的關聯(lián)性，應用ELISA從多個免疫因子中最終篩選出TGFβ1這個EPAC2和Calpain的中間連接因子。
　　為了逆轉EPAC2下調(diào)帶來的Tau病變，我們應用了Calpain抑制劑Calpain i

5、nhibitorⅣ和CDK5抑制劑Roscovitine腦立體定位注射到EPAC2-/-小鼠側腦室，用免疫印跡檢測是否對EPAC2下調(diào)導致的Tau過度磷酸化有修復作用。
　　結果：
　　1、EPAC2下調(diào)導致Tau蛋白過度磷酸化，不可溶Tau蛋白增加、神經(jīng)纖維纏結形成等Tau病變。
　　為了探討EPAC2下調(diào)對Tau蛋白的影響，我們首先應用EPAC2-/-轉基因小鼠和si-EPAC2質(zhì)粒在動物和細胞水平造成EPAC2下

6、調(diào)的環(huán)境，再取樣分析Tau蛋白的磷酸化程度。結果顯示從6月齡開始，EPAC2下調(diào)后Tau蛋白磷酸化水平增加，pT205、pT231、pS396、pS404位點的磷酸化程度也增加。隨后我們把6月齡 EPAC2+/+和EPAC2-/-小鼠腦組織樣品分為可溶組分和不可溶組分，發(fā)現(xiàn)EPAC2-/-小鼠的Tau蛋白在不可溶組分中明顯增加。Bielschowsky銀染顯示，EPAC2-/-小鼠腦內(nèi)9月齡時即出現(xiàn)明顯Tau過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結

7、。
　　2、EPAC2下調(diào)通過激活CDK5影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
　　Tau蛋白磷酸化是相關激酶酯酶調(diào)節(jié)失衡的結果，為了找出在EPAC2下調(diào)體系中影響Tau蛋白磷酸化的關鍵因子，我們對相關激酶酯酶進行了篩查，最后發(fā)現(xiàn)CDK5在EPAC2下調(diào)后活性成分表達明顯增加，下調(diào)CDK5可逆轉EPAC2下調(diào)引起的Tau蛋白過度磷酸化。
　　3、EPAC2下調(diào)通過激活Calpain活化CDK5。
　　Calpain是調(diào)節(jié)C

8、DK5活性主要因子，檢測顯示EPAC2-/-小鼠Calpain活性明顯高于EPAC2+/+小鼠。在EPAC2-/-小鼠體內(nèi)下調(diào)Calpain后CDK5活性降低，Tau磷酸化病變得到逆轉。
　　4、EPAC2下調(diào)激活TGF-β1/Calpain/CDK5通路影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
　　經(jīng)驗證，EPAC2對Calpain、CDK5的激活不是通過傳統(tǒng)的Ca2+活化造成的，為了找到EPAC2對CDK5的調(diào)節(jié)作用，我們篩選出TGF

9、-β1這個炎癥因子，進一步通過TGF-β1/Calpain/CDK5通路進行研究。
　　結論：
　　1、EPAC2下調(diào)導致Tau蛋白過度磷酸化，不可溶Tau蛋白增加、神經(jīng)纖維纏結形成等Tau病變。
　　2、EPAC2下調(diào)通過激活CDK5影響Tau蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。
　　3、EPAC2下調(diào)通過激活Calpain活化CDK5。
　　4、EPAC2下調(diào)激活TGF-β1/Calpain/CDK5通路影響Tau蛋白磷酸