STAT3和SOCS3對神經再生作用的研究.pdf

1、成熟的中樞神經系統(tǒng)（CNS）損傷后，損傷的軸突通常便失去了再生的能力。而成熟的周圍神經系統(tǒng)（PNS）損傷后，在未傷及其靶組織的情況下，受損的軸突仍然能夠成功再生。 目前已經證實，造成中樞神經系統(tǒng)再生受限的主要障礙有兩種。一種是不利于膠質細胞軸突生長的環(huán)境，其特點為髓鞘碎片，膠質瘢痕，空化以及易化分子缺乏。另一種是損傷的中樞神經系統(tǒng)神經元失去對有利于軸突再生的基因表達的控制。越來越多的證據(jù)表明，抑制信號的傳導過程有利于克服中樞神經

2、的再生障礙，但必須與激活神經細胞內在生長狀態(tài)相結合，從而使軸突能夠成功再生。 背根神經節(jié)（DRGs）的初級感覺神經元大量聚集形成神經叢，成為適合對CNS以及PNS再生能力進行比較的細胞元群體。這些神經元同時具有中樞神經和外周神經的軸突。周圍神經的神經支受損傷后，可表現(xiàn)出旺盛的再生能力，最終實現(xiàn)功能性恢復。與之相反，中樞神經的神經支損傷后，其軸突的再生能力較差。 研究顯示，將成年小鼠或大鼠的坐骨神經近端在其進一步損傷之前2

3、-28天壓碎或橫斷，軸突的再生能力增強，速度加快3倍。背柱橫切后，伴隨損傷而生長成為周圍神經片段的背根神經節(jié)神經元的中樞突數(shù)量增加了100倍。此外，1-2周前發(fā)生的周圍神經損傷會導致中樞支在脊髓背柱損傷部位的內外再生。因此，神經生長能力的增強是條件性損傷誘導的神經元反應的結果，與神經細胞體中的轉錄激活相關。 信號轉導是當前神經損傷后軸突再生研究的熱點領域。信號轉導和轉錄激活蛋白STAT3被許多細胞因子和生長因子激活而介導多種生理

4、過程。STAT3蛋白含有DNA結合域，SH2區(qū)和轉錄激活區(qū)等保守區(qū)域，通過705位酪氨酸的磷酸化而激活，形成二聚體，入核與特異DNA元件結合，啟動靶基因的轉錄。STAT3在神經系統(tǒng)的發(fā)育過程中有表達，并與其他信號途徑協(xié)同調節(jié)體內神經前體細胞的分化命運，STAT3結合元件的甲基化狀態(tài)還決定了細胞的分化潛能。 STAT3蛋白還參與維持神經細胞的存活和促進神經損傷后的再生。已證明JAK/STAT信號轉導是在外周神經細胞軸索切斷后被激

5、活的，并且它對神經再生和神經元存活是至關重要的。在外周神經橫斷后，新生運動神經元中STAT3蛋白表達顯著增加并可以被Tyr705磷酸化而激活。坐骨神經損傷后的STAT3磷酸化能被持續(xù)從神經束膜注入至最近神經殘端的JAK2抑制物AG490所阻斷。在體外，神經束膜注入的AG490能阻礙神經軸突的增生，在條件損傷坐骨神經后，AG490也能顯著降低成熟的成人脊髓中神經元軸突再生。由此推斷：條件損傷后，STAT3的活化作用對提高傷后DRG感覺神經

6、元生長能力是至關重要的。 細胞因子信號轉導抑制因子（SOCS）是可以抑制JA K/STA T信號通路的負調控因子。1997年以來，相繼發(fā)現(xiàn)SOCS家族的CIS和SOCS1～7共8個成員，其中SOCS3可與細胞因子受體相結合，使其在空間結構上與JA Ks緊密相鄰，同時結合并抑制JA Ks激酶的活性，以抑制STA T3的磷酸化。大鼠周圍神經損傷后，在其背根神經節(jié)中檢測的SOCS3 mRNA表明了一個明顯的抑制作用。 病毒載體

7、是目前基因研究和治療中多采用的目的基因的轉移工具，腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒及慢病毒等病毒載體系統(tǒng)是應用的比較多的。本研究使用的是慢病毒載體。慢病毒為非致癌性病毒，能感染多種臟器，其特點為持續(xù)時間長、潛伏期長的慢性感染，屬逆轉錄病毒家族。慢病毒的特點是在包膜基因和逆轉錄酶基因之間以及3’端包膜蛋白基因區(qū)含有開放性讀碼框，目前由人類免疫缺陷Ⅰ型病毒演變而來慢病毒是最常用的。為增加其安全性，以刪除vpr、vpu、nef、vif基因的質粒

8、包裝慢病毒載體。構建慢病毒載體時，在3’長末端重復系列的U3區(qū)，通過刪除133bp堿基以達到病毒載體的自身滅活，而5’長末端重復系列的U3區(qū)以巨細胞病毒（CMV）啟動子取代。慢病毒能攜帶9kb容量的外源基因，對神經元具有高度親嗜性，不具有逆向轉運的能力，作為表達載體在中樞系統(tǒng)研究中應用非常理想。 此項研究的目的是構建攜帶信號轉導和轉錄激活蛋白STAT3和基因突變的雌激素受體ER的慢病毒載體，并轉染受損的大鼠背根神經節(jié)神經元，研究

9、其對神經元突起再生的作用；通過慢病毒轉導SOCS3和作用相反的突變的SOCS3（m SOCS3），體外研究SOCS3在成年鼠的初級感覺神經元再生中的作用；探討STAT3和SOCS3在神經元軸突再生中的相互作用及關聯(lián)性。 本實驗運用基因重組技術，將STAT3、ER和核糖體介導的綠色熒光蛋白（IRES-GFP）片段插入慢病毒載體pRRL-MCS+的PmeI位點構建慢病毒載體pRRL-STAT3ER-IRES-GFP，經RT-PCR、

10、western blotting和測序分析加以鑒定其正確性。將慢病毒載體質粒pRRL-SOCS3-IRES-GFP，pRRL-mSOCS3-IRES-GFP和pRRL-STAT3ER-IRES-GFP分別轉染293T細胞，包裝慢病毒載體并測定滴度。切斷大鼠左L5近神經節(jié)的神經根，摘取L5背根神經節(jié)做分離神經元培養(yǎng)，陽性對照的大鼠，在搗碎背根前立即在髖部橫斷左側坐骨神經（SN）。分別將三種慢病毒載體感染神經元細胞，采用免疫熒光染色法觀察神

11、經元細胞核質反應和突起的長度，通過實時PCR和原位雜交檢測DRG s中SOCS3mRNA的存在。 實驗結果是構建的慢病毒載體pRRL-STAT3ER-IRES-GFP經RT-PCR和western blotting鑒定正確；測序分析與Genbank報道的STAT3基因序列完全一致。三質粒共轉染293T細胞后，測定慢病毒滴度為1010-11TU/ml。轉染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神經元經4-羥基三苯氧胺（4HT

12、）激活，STAT3ER有明顯的核轉運，并增強突起的生長，經X2檢驗與對照組有顯著性差異。在神經損傷后SOCS3 mRNA的濃度在背根神經節(jié)神經元中明顯增加，外源性SOCS3能阻止神經元中STAT3的磷酸化及核移位，mSOCS3增強了突起生長。 實驗結論： 1.成功構建了表達小鼠STAT3ER基因的慢病毒載體。 2.證實了STAT3信號轉導有利于軸突生長。 3.SOCS3通過抑制STAT3和/或其他轉導因子