Rho亞家族蛋白在EGF介導的人滋養(yǎng)細胞遷移中的作用及機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　 胎盤是人類胚胎發(fā)育成熟、妊娠順利完成的基本要素。晚期囊胚著床之后,絨毛外滋養(yǎng)層細胞(extravillous trophoblast cell,EVT)向子宮蛻膜層和肌層血管的進一步侵襲、遷移、分化是母-胎循環(huán)建立和胎盤錨著固定的關鍵環(huán)節(jié),對胎盤的形成尤為重要。已證實,EVT侵襲性遷移不足可導致子宮螺旋動脈重鑄不足,是流產、子癇前期/子癇、胎兒宮內生長受限等疾病的重要病理過程;同時,滋養(yǎng)細胞過度侵襲則是胎盤植

2、入、葡萄胎、絨癌等疾病的重要病理特征。明確滋養(yǎng)細胞侵襲性遷移的調節(jié)機制,是解決上述疾病的關鍵問題與希望所在。EVT的侵襲性遷移是由細胞粘附、胞外基質降解、運動遷移、穿越基底膜等多個環(huán)節(jié)構成多元化過程,受到體內微環(huán)境的精確調節(jié)。蛻膜/胎盤等局部器官、組織和/或機體其它器官、組織分泌的內源性因子如內分泌激素、細胞因子等能夠作用于EVT的侵襲性遷移過程,是調節(jié)該過程的重要因素。但各種因素調節(jié)EVT侵襲性遷移的確切分子機制至今尚未闡明。

3、　　 表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)是一種對機體發(fā)育、代謝等多種生物學過程具有調節(jié)作用的重要的生長因子。已有證據(jù)表明,EGF及EGFR在人類妊娠組織的蛻膜層和滋養(yǎng)層均有表達,且EGF在滋養(yǎng)層的表達水平隨妊娠進展而逐漸下降,提示其在妊娠早期滋養(yǎng)層的發(fā)育過程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn),EGF對滋養(yǎng)層細胞的增殖、凋亡、分化、能量代謝、激素分泌、侵襲和遷移等多種生物學行為均存在調控,妊娠動物母體EGF的缺

4、乏亦可造成明確的胎盤發(fā)育不良、子代宮內生長受限。因此,EGF對滋養(yǎng)細胞功能的調控研究成為本領域近年來的重要方向。
　　 EGF通過與細胞表面表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的高親和力結合而使EGFR內在的酪氨酸激酶活性激活,啟動胞內信號傳導級聯(lián)反應。已發(fā)現(xiàn)受EGF/EGFR激活的信號通路包括:Ras/MAPK,P13K/Akt,PLC/PKC和STAT等。Rho亞家族

5、蛋白(Rho subfamily)屬于Ras超家族小分子G蛋白范疇,主要包括RhoA、RhoB、RhoC等3個成員,它們在細胞的信號轉導通路中作為分子開關作用于其下游靶效應分子調節(jié)細胞骨架的聚合與重建,進而參與調控細胞的粘附、細胞的極性和細胞遷移。Rho亞家族成員具有高度同源性,RhoA、RhoB、RhoC蛋白的氨基序列結構約有85％相同,但在胞內信號傳導通路中的分工有所不同。早已發(fā)現(xiàn),EGFR的激活能夠通過Rho信號途徑調節(jié)胞膜皺縮、

6、骨架重組、局部粘附等對遷移、運動至關重要的細胞行為特性,但Rho蛋白各亞型在EGF介導的人滋養(yǎng)細胞遷移中的作用及機制至今未見報道。
　　 JEG-3和JAR細胞系分別來自人絨毛膜癌和人胎盤部位滋養(yǎng)細胞腫瘤組織,其細胞形態(tài)、生化標志、激素合成分泌等特征與原代絨毛滋養(yǎng)細胞極其相似,且細胞表面均表達EGFR。本研究基于JEG-3、JAR等兩種滋養(yǎng)細胞系和人早孕絨毛體外培養(yǎng)等實驗平臺,應用Transwell、Western blot、R

7、NAi等實驗技術,研究并探討Rho亞家族蛋白在EGF介導的人滋養(yǎng)細胞遷移中的作用及其機制。
　　 主要結果和結論如下:
　　 1.EGF以劑量依賴模式作用于人滋養(yǎng)細胞的遷移行為。在測試的濃度中,1ng/ml的EGF最大程度的上調JEG-3、JAR細胞的遷移行為(P＜0.01);濃度升高至10ng/ml時其上調效應有所下降;濃度升高至100ng/ml時EGF的遷移調節(jié)作用轉為抑制(P＜0.01)。相同的實驗條件下,JEG-

8、3、JAR細胞的數(shù)目、增殖、凋亡等無顯著變化。
　　 2.Rho蛋白活性抑制劑-C3胞外酶(5mg/ml)顯著抑制JEG-3、JAR細胞的遷移(P＜0.01);C3預處理細胞后,EGF對細胞遷移的激活作用也被抑制(P＜0.01);相同實驗條件下,細胞的數(shù)目、增殖、凋亡等無顯著變化;同時,EGF還顯著上調早孕絨毛組織EVT細胞的外生性遷移(P＜0.01),而C3可將此作用阻斷(P＜0.01)。
　　 3.EGF處理JEG-

9、3、JAR細胞后,RhoA和RhoC的表達顯著上調(P＜0.01),而RhoB的表達輕微下調(P＜0.01),EGF處理絨毛組織后Rho表達譜與細胞結果相近;在3種實驗平臺,EGF處理均使處于活性狀態(tài)的RhoA和RhoC水平升高(P＜0.01),而RhoB水平無顯著變化。
　　 4.分別沉默RhoA和RhoC均能顯著的抑制JEG-3、JAR細胞的遷移行為(P＜0.05),EGF對細胞遷移的刺激作用也同時被抑制(P＜0.01);相

10、同實驗條件,沉默RhoA和RhoC對細胞的數(shù)目、增殖、凋亡等行為均無顯著影響。
　　 5.C3處理(5mg/ml,2h)的JEG-3、JAR細胞出現(xiàn)細胞皺縮、細胞微絲骨架解聚、不規(guī)則等表現(xiàn),C3處理之后應用EGF刺激不能使細胞形態(tài)和骨架復原。沉默RhoA(100nM,24h),后細胞出現(xiàn)與C3處理相似的細胞皺縮、骨架解聚等表現(xiàn),不能被EGF復原。而RhoC沉默(100nM,24h)后細胞的形態(tài)、微絲骨架等未發(fā)生明顯可見的變化。<