淋巴性腦水腫大鼠的血壓變化及其機制探討.pdf

1、目的：1.探討LBE對清醒自由活動大鼠血壓及血壓調(diào)節(jié)的影響；2.探討孤束背內(nèi)側亞核的組織病理變化在LBE后血壓及血壓調(diào)節(jié)的改變中的作用；3.探討AQP4在LBE中的作用；4.探討血漿AngII及ANP在LBE后血壓及血壓調(diào)節(jié)的改變中的作用。 方法：1.淋巴性腦水腫動物模型的建立選用健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，參照Casley-Smith創(chuàng)立的并由本實驗室改進的方法建立淋巴性腦水腫動物模型。具體方法如下：大鼠在鹽

2、酸氯胺酮50 mg/kg和地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉下，取仰臥位固定，頸部正中切口，分離兩側的頸淺淋巴結(每側各3～5個)，結扎相應的淋巴管，并摘除頸淺淋巴結。然后進一步分離出兩側的頸深淋巴結(每側各1～2個)，同法結扎其兩端的淋巴管，并摘除頸深淋巴結，阻斷頸部淋巴引流，造成淋巴性腦水腫；2.動物分組動物隨機分為以下三組：(1)正常組(Normal組)：僅進行股動、靜脈插管進行血壓監(jiān)測，不接受頸部手術，不形成淋巴性腦水腫。(2)淋

3、巴性腦水腫假手術組(Sham組)：只進行頸部假手術，即分離頸部的淋巴管及淋巴結，但不結扎淋巴管，也不摘除淋巴結，不形成淋巴性腦水腫。(3)淋巴性腦水腫模型組(LBE組)：進行頸部手術，分離頸部的淋巴管及淋巴結，結扎淋巴管，并且摘除淋巴結造成淋巴性腦水腫；3.檢測指標與方法(1)應用清醒動物血壓監(jiān)測技術觀察淋巴性腦水腫術后清醒自由活動大鼠血壓、心率、血壓波動性、心率變異性及壓力反射敏感性隨時間的變化規(guī)律。(2)應用透射電鏡技術觀察LBE后

4、孤束核背內(nèi)側亞核(dorsomedial nucleusof the solitary tract，dmNTS)病理組織學改變。應用抗神經(jīng)元抗體免疫組化染色檢測LBE后dmNTS內(nèi)主要參與血壓調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，GLU)及γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)表達的改變。應用抗神經(jīng)元抗體免疫熒光染色dmNTS內(nèi)谷氨酸脫羧酶67(glutamic aciddecarboxyl

5、ase-67，GAD67)表達的改變。應用RT-PCR及Western blotting技術檢測LBE對孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)內(nèi)GAD67信使核糖核酸(mRNA)及蛋白表達的改變。(3)應用干濕重法檢測LBE對腦干腦水含量改變。應用RT-PCR技術檢測LBE對NTS內(nèi)水通道蛋白AQP4 mRNA表達的改變。應用抗神經(jīng)元抗體免疫熒光染色技術檢測各時間點dmNTS的AQP4蛋白表達的的變

6、化。應用Westernblotting技術，檢測LBE對NTS內(nèi)AQP4蛋白表達的影響。并將AQP4的表達與腦水含量進行相關分析。(4)應用特異性放射免疫均相競爭分析法(radioimmunoassay，RIA)，檢測LBE術后大鼠各時間點血漿血管活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ及心房鈉尿肽含量水平，并與血壓作相關分析；4.統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(x±s)表示。各組間比較采用單因素方差分析和多重比較檢驗。P＜0.05認為有顯著性差異。

7、 結果：1.LBE對清醒自由活動大鼠血壓及血壓調(diào)節(jié)功能的影響假手術組各參數(shù)與正常組比較無統(tǒng)計學意義。與假手術組相比，LBE術后第1天SBP、DBP、MAP、HR開始下降(P＜0.05)，第7天降至最低(P＜0.01)，其數(shù)值分別為111.10±10.79 mmHg，70.46±9.98 mmHg，84.00±7.56 mmHg和324.06±18.06 bpm，至21天恢復正常。相反，SBPV、DBPV及HRV則在LBE術后第1天出

8、現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)，第7天升至最高點(P＜0.01)，與假手術組相比分別增加56.65％，69.10％and 40.95％，后逐漸降低，至21天恢復正常。BRS變化趨勢與血壓、心率趨勢相同，與假手術組相比，LBE后第1、7和15天分別降低23.81％，30％和23.53％(P＜0.01)；2.LBE對孤束核背內(nèi)側亞核神經(jīng)細胞病理組織學的影響透射電鏡超微結構觀察發(fā)現(xiàn)，LBE后神經(jīng)元細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜、核膜不清晰、水腫，細胞質(zhì)

9、少，并出現(xiàn)裂隙、大液泡，核染色深，神經(jīng)元異染色質(zhì)顯著增多、邊集。膠質(zhì)細胞膜水腫，周圍出現(xiàn)空泡變性。髓鞘變性壞死，血管內(nèi)皮細胞膜水腫，并出現(xiàn)周圍裂隙。以LBE7天變化顯著。免疫組織化學觀察發(fā)現(xiàn)LBE后1天Glu免疫組化陽性染色細胞增多，至7天陽性神經(jīng)元數(shù)目最多和染色強度最高，以后逐漸恢復。LBE后1天GABA免疫組化陽性染色細胞即見減少，至7天陽性神經(jīng)元數(shù)目最少，免疫染色強度最低，以后逐漸改善；3.LBE對孤束核GAD表達的影響免疫熒光結

10、果顯示，假手術組和正常組大鼠dmNTS神經(jīng)元GAD67蛋白表達無顯著性差異。與假手術組比較，LBE組大鼠自術后1天GAD67免疫熒光陽性染色細胞即明顯增多，以LBE 7天最顯著(P＜0.01)，21天恢復正常。RT-PCR。結果顯示，LBE術后1天NTS組織就有較假手術組高的GAD67 mRNA表達(P＜0.05)，7天達到表達的高峰(P＜0.01)，Sham組和正常組GAD67表達水平相似(P＞0.05)。Western blotti

11、ng結果顯示GAD67蛋白的表達與mRNA表達呈現(xiàn)相同的趨勢，在LBE術后7天升高94.7％。 4.LBE對腦干腦水含量及孤束核AQP4表達的影響腦干水含量測定結果顯示，正常組和假手術組大鼠腦含水量在各個時點無明顯差異(P＞0.05)。與假手術組同一時間點相比，LBE組大鼠自術后1天腦組織含水量明顯升高，7天達高峰，后逐漸恢復；5.LBE對血漿中AngII及ANP含量水平的影響與假手術組相比較，LBE大鼠血漿ANP含量顯著升高(分別為P

12、＜0.05和P＜0.01)，峰值出現(xiàn)在7天。AngII含量顯著降低(分別為P＜0.05和P＜0.01)，谷值出現(xiàn)在7天。正常組和假手術組大鼠血漿ANP和AngII含量在各個時點無明顯差異。相關分析顯示，AngII和ANP含量與LBE大鼠血壓均呈顯著正相關(r=0.9584，P＜0.01)和顯著負相關(r=-0.9103，P＜0.01)。 結論：1.淋巴性腦水腫可導致清醒自由活動大鼠血壓及血壓調(diào)節(jié)功能的降低；2.淋巴性腦水腫對孤束