沙門(mén)氏菌脂肪酸分型的研究及快速診斷方法的建立.pdf

1、目的：沙門(mén)氏菌是國(guó)際公認(rèn)的危害最嚴(yán)重的食源性致病菌。傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法操作繁瑣，通常需時(shí)4～7天；在流行病學(xué)診斷中常用的沙門(mén)氏菌分子生物學(xué)分型方法，要在獲得可疑爆發(fā)菌株純培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上進(jìn)行，不僅消耗大，需時(shí)也較長(zhǎng)，難以滿(mǎn)足食物中毒快速診斷及有效防控的需要。脂肪酸分型方法將甲基脂肪酸提取與靈敏的氣相色譜檢測(cè)法結(jié)合，通過(guò)分析微生物細(xì)胞膜上的磷脂脂肪酸的組成，來(lái)鑒定微生物的種屬、分析微生物的多樣性?；诖嗽黹_(kāi)發(fā)的微生物鑒定自動(dòng)化系統(tǒng)Sh

2、erlock MIS可比傳統(tǒng)方法最少提前24h出具鑒定結(jié)果，獲得的數(shù)據(jù)可直接應(yīng)用系統(tǒng)附帶的軟件進(jìn)行基于菌株脂肪酸成分的聚類(lèi)分析，大大縮短流行病學(xué)診斷所需時(shí)間，且操作簡(jiǎn)便，特別適用于大通量標(biāo)本的分析。但是，現(xiàn)有的Sherlock數(shù)據(jù)庫(kù)中僅包含五種血清型沙門(mén)氏菌的脂肪酸數(shù)據(jù)，尤其是不包括我國(guó)流行的沙門(mén)氏菌脂肪酸成分的基礎(chǔ)資料，使得該系統(tǒng)在我國(guó)的應(yīng)用受到一定的限制。本研究選擇2005年～2007年河北省17個(gè)血清型的130株沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行

3、脂肪酸分型研究，目的是建立適合我國(guó)沙門(mén)氏菌脂肪酸分型快速診斷的實(shí)驗(yàn)條件和方法，探討我國(guó)沙門(mén)氏菌流行株的脂肪酸構(gòu)成特征，在提供我國(guó)沙門(mén)氏菌脂肪酸組成本底資料基礎(chǔ)上，補(bǔ)充和完善沙門(mén)氏菌脂肪酸數(shù)據(jù)庫(kù)，為在我國(guó)應(yīng)用Sherlock MIS進(jìn)行沙門(mén)氏菌快速診斷提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.沙門(mén)氏菌脂肪酸分型快速診斷方法的建立：將豬霍亂沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株分別在TSBA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)24h和TSA培養(yǎng)基+5％去纖維綿羊血35℃培養(yǎng)

4、24h兩種條件下培養(yǎng)，提取脂肪酸進(jìn)行鑒定，分別與TSBA6和CLIN6數(shù)據(jù)庫(kù)匹配。另在培養(yǎng)條件固定前提下設(shè)置25mg～35mg、35mg～45mg、45mg～55mg三個(gè)取菌量組，分別在不同獲菌量條件下對(duì)豬霍亂標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行脂肪酸提取和鑒定。實(shí)驗(yàn)各重復(fù)十次，確立沙門(mén)氏菌脂肪酸分型鑒定的最佳培養(yǎng)條件及最佳獲菌量范圍。應(yīng)用建立的方法對(duì)130株沙門(mén)氏菌及130株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行脂肪酸分型鑒定，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性。
　　 2.沙

5、門(mén)氏菌脂肪酸分型研究：應(yīng)用建立的方法對(duì)2005年～2007年河北省17個(gè)血清型的130株沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行脂肪酸組成及含量分析，提供我國(guó)沙門(mén)氏菌流行株特征脂肪酸組成數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)脂肪酸分型方法對(duì)沙門(mén)氏菌的分型能力。
　　 3.脂肪酸分型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型（PFGE）方法在食物中毒流行病學(xué)診斷上的應(yīng)用比較：同時(shí)應(yīng)用兩種分型方法對(duì)17株分離于一起沙門(mén)氏菌食物中毒的可疑爆發(fā)株及10株非相關(guān)的沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行菌株同源性分析。比較方法間優(yōu)

6、劣，探討脂肪酸分型方法在流行病學(xué)診斷上的應(yīng)用前景。
　　 結(jié)果：應(yīng)用TSBA培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)和控制獲菌量為40mg，進(jìn)行沙門(mén)氏菌脂肪酸分型，對(duì)沙門(mén)氏菌鑒定的準(zhǔn)確性達(dá)92.3％，特異性為100％，重復(fù)性為90％。以此作為標(biāo)準(zhǔn)參考方法對(duì)17個(gè)血清型的130株沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行脂肪酸分析，共得到19種不同脂肪酸成分，其中所有菌株都含有的脂肪酸成分有12種，占優(yōu)勢(shì)的脂肪酸成分為：12：0、14：0、16：0、17：Ocyclo、

7、SumInFeature2、SumInFeature3，SumInFeature8，較Sherlock數(shù)據(jù)庫(kù)多了14：02OH、17：0、18：0、18：1ω9c。不同血清型沙門(mén)氏菌共有脂肪酸成分非常接近，僅有1～2種脂肪酸成分的差異。本次檢測(cè)的腸炎沙門(mén)菌分離株具有另外四種共有成分13：0、16：1ω5c、14：02OH、18：1ω9c；豬霍亂沙門(mén)菌具有另外兩種共有成分16：1ω5c、18：1ω9c，而缺少了19：Oiso。本實(shí)驗(yàn)中腸炎

8、沙門(mén)菌17：0含量低于數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，而18：0含量遠(yuǎn)高于庫(kù)中值；豬霍亂沙門(mén)菌17：Ocyclo含量遠(yuǎn)低于數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)值，而18：0含量高于庫(kù)中值。同時(shí)運(yùn)用PFGE和脂肪酸分型方法進(jìn)行菌株同源性分析結(jié)果顯示，在小樣本暴發(fā)資料的研究中脂肪酸分型方法能夠反映菌株之間的親緣關(guān)系，聚類(lèi)結(jié)果與脈沖場(chǎng)分型總體一致。但在菌株同源性判斷的精確性上與細(xì)菌分型“金標(biāo)準(zhǔn)”P(pán)FGE還有差距。
　　 結(jié)論：
　　 1.優(yōu)化了細(xì)菌脂肪酸分析分型的實(shí)驗(yàn)條件，

9、建立了沙門(mén)氏菌脂肪酸分型標(biāo)準(zhǔn)參考方法。使用TSBA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h，控制獲菌量在40mg（35～45mg），獲得的沙門(mén)氏菌的脂肪酸數(shù)據(jù)與Sherlock數(shù)據(jù)庫(kù)匹配最佳，鑒定結(jié)果最準(zhǔn)確。在此基礎(chǔ)上建立的沙門(mén)氏菌脂肪酸分型快速診斷方法可通過(guò)單次實(shí)驗(yàn)較準(zhǔn)確地將沙門(mén)氏菌鑒定到種。
　　 2.提供了我國(guó)沙門(mén)氏菌流行株脂肪酸組成本底資料，補(bǔ)充和完善了Sherlock沙門(mén)氏菌脂肪酸數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　 3.通過(guò)與脈沖場(chǎng)分型方法比較，