Pin1調(diào)控DNA損傷反應中p53穩(wěn)定性和腫瘤細胞凋亡誘導能力的機制研究.pdf

1、在腫瘤治療中，應用電離輻射和腫瘤化療藥物等DNA損傷劑誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的主要策略。野生型p53是DNA損傷后細胞應激反應中決定細胞生死命運的關鍵調(diào)控因子。DNA損傷反應引發(fā)p53發(fā)生磷酸化等一系列化學修飾，從而使得p53穩(wěn)定性增強并累積，轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游基因表達。 DNA損傷反應中p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性的升高精密地依靠多個位于脯氨酸前的絲、蘇氨酸殘基的磷酸化。研究進展表明，那些被磷酸化修飾的Ser-/Thr-Pro基

2、序還受到肽基—脯氨酰順/反異構酶即Pinl的調(diào)控。Pinl特異催化肽-脯氨酰間肽鍵發(fā)生順反異構化，誘導底物發(fā)生構象改變，進而調(diào)控其化學修飾、穩(wěn)定性、亞細胞定位以及與其它蛋白的相互作用。 先前基于正常細胞的研究表明，在電離輻射、紫外照射等引發(fā)的DNA損傷反應中，Pinl與磷酸化的p53結合并調(diào)控增強p53的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激活能力。然而其細胞學后果卻還存在存在著相互矛盾的實驗事實，表現(xiàn)為：一方面Pinl通過維持細胞周期檢查點機制避免細

3、胞凋亡，另一方面Pinl通過增強促凋亡基因表達促進細胞凋亡。對于腫瘤細胞DNA損傷反應中Pinl如何調(diào)控p53的穩(wěn)定性和凋亡誘導功能目前還不清楚。這是因為Pinl在多種腫瘤組織中異常高表達，促進細胞增殖和轉(zhuǎn)化，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的“催化劑”。Pinl的這種功能與p53的腫瘤抑制作用相互拮抗。已有報道，腫瘤細胞中p53被癌基因類激酶修飾后產(chǎn)生pSer-Thr-Pro基序，正是Pinl結合所需位點。那么腫瘤細胞非應激狀態(tài)下Pinl與p53是否

4、存在相互作用?Pinl是否對p53起負調(diào)控作用?由于泛素化E3-連接酶Mdm2是p53的主要負調(diào)控分子，它介導p53經(jīng)由泛素化蛋白酶體途徑降解。那么，在腫瘤細胞中Pinl是否通過促進Mdm2對p53的降解而對p53發(fā)揮負調(diào)控作用?在腫瘤細胞DNA損傷反應中，p53分子中可能產(chǎn)生多個滿足Pinl結合所需的磷酸化Ser-/Thr-Pro基序，Pinl是否通過與之結合并調(diào)控p53構象，進而抑制p53-Mdm2相互作用，增強p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激

5、活能力，促進細胞凋亡?Pinl對不同DNA損傷劑順鉑、電離輻射以及阿霉素等誘導的腫瘤細胞凋亡反應有何影響? 本研究針對上述問題進行探索，并取得了以下研究進展： 1．選用Pinl過表達的人乳腺癌細胞系MCF-7，采用載體介導的RNA干涉技術成功構建了穩(wěn)定抑制Pinl表達的MCF-7細胞模型，為在腫瘤細胞中開展Pinl功能研究打下了良好基礎。 2．利用該模型研究發(fā)現(xiàn)：在非應激條件下Pinl可通過促進p53與MDM2結

6、合降低p53穩(wěn)定性，對p53發(fā)揮負調(diào)控作用。Western blot和RT-PCR-檢測發(fā)現(xiàn)，Pinlknockdown導致p53蛋白表達水平升高，而mRNA表達無明顯變化。說明Pinl對p53表達水平的調(diào)控是蛋白水平而不是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。免疫熒光顯示Pinl與p53在MCF．7細胞中能夠共定位，免疫共沉淀實驗證明非應激條件下MCF-7細胞中p53的Ser315(-Pro316)位存在磷酸化修飾，并且Pinl與p53存在相互作用。研究還

7、發(fā)現(xiàn)，Pinl knockdown導致p53與MDM2結合減少，因此部分增強了p53穩(wěn)定性。上述結果說明在非應激條件下Pinl與p53結合后通過改變其構象，促進了p53與具有E3連接酶功能的MDM2結合，進而促進其對p53的泛素化降解，降低了p53穩(wěn)定性。 3．在研究順鉑處理引發(fā)的DNA損傷反應中發(fā)現(xiàn)：Pinl是順鉑所致DNA損傷反應中抑制Mdm2與p53結合及其介導的泛素化降解，增強p53穩(wěn)定性的重要正調(diào)因子。Pinl kno

8、ckdown導致p53蛋白穩(wěn)定性受到顯著損害，累積降低。免疫共沉淀實驗證明，順鉑處理12h顯著地抑制Mdm2與p53的結合，導致p53累積增加；而Pinl knockdown細胞中Mdm2與p53的結合量明顯高于對照細胞，p53累積則顯著降低，表明Pinl在DNA損傷反應中通過抑制p53與Mdm2的相互作用，促進增強p53穩(wěn)定性和累積，發(fā)揮重要的正調(diào)控作用。電離輻射處理得到了類似的結果。 4．用p53下游靶基因p21<'WAF/

9、<'cipl>啟動子構建的熒光素酶報告載體實驗揭示，Pinlknockdown導致p53的轉(zhuǎn)錄激活能力顯著降低。干涉Pinl后，p53轉(zhuǎn)錄激活能力降低了60％左右。同時進行外源p53過表達的實驗更進一步證明，即使在p53表達水平很高的情況下，當Pinl knockdown時，p53的轉(zhuǎn)錄激活能力仍然很低，可能的原因是，Pinl knockdown時高表達水平的p53并不能有效地與靶基因啟動子結合，因此轉(zhuǎn)錄激活靶基因的能力顯著下降，說明P

10、inl可能主要是通過促進p53與下游靶基因啟動子的結合來增強p53轉(zhuǎn)錄激活能力。在順鉑以及電離輻射處理后對內(nèi)源性p53下游基因表達的檢測同樣證明了，Pinl knockdown導致p53轉(zhuǎn)錄激活細胞周期抑制基因p21<'WAF.cipl>和促凋亡基因Bax的能力受到顯著損害。 5．利用流式細胞術檢測Pinl knockdown對p53誘導的細胞周期阻滯和細胞凋亡的影響，研究發(fā)現(xiàn)，Pinl干涉導致MCF-7細胞S期阻滯明顯降低，表

11、明p53激活DNA復制檢查點的能力受到損害，這與干涉Pinl后p21/表達水平顯著下降的結果相一致。同時還發(fā)現(xiàn)，Pinl干涉細胞經(jīng)順鉑處理誘發(fā)的細胞凋亡減少約50％，表明Pinl干涉嚴重抑制順鉑誘導的MCF-7細胞凋亡，這與促凋亡基因Bax表達下降相一致。 6．為了考察Pinl在不同DNA損傷劑處理條件下的作用，檢測了拓撲異構酶Ⅱ類化療藥物阿霉素處理后p53表達水平的變化，結果顯示，與順鉑、電離輻射處理后的變化

12、不同，與對照細胞比較Pinl干涉細胞p53表達水平明顯升高，p53下游抗凋亡基因Survivin的表達下降。臺盼藍染色計數(shù)死細胞顯示，Pinl干涉細胞死亡率增高10％，Giema染色顯示凋亡核顯著增加。上述結果表明，在阿霉素處理中Pinl調(diào)控p53穩(wěn)定性及功能活化的機制與順鉑、電離輻射處理時不同，Pinl knockdown對阿霉素誘導的腫瘤細胞凋亡有一定的增敏作用，可能與 Pinl knockdown后凋亡誘導基因p53表達升高，抗凋

13、亡蛋白Survivin表達下降有關，其詳細的作用機制尚需進一步深入研究。 7．研究進展揭示：由于p53．Survivin通路是DNA損傷劑阿霉素等有別于順鉑誘導細胞凋亡的一條基本通路，抗凋亡蛋白Survivin的表達受到p53轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控，而Pinl knockdown后p53表達水平增高，因此檢測了Pinl干涉前后Survivin表達的變化。結果表明，Pinl干涉后Survivin mRNA表達水平?jīng)]有變化，而蛋、白表達水平顯

14、著降低，半衰期縮短，說明Pinl干涉后Survivin蛋白表達水平降低不是由于p53轉(zhuǎn)錄抑制Survivin基因表達引起的，而是Pinl干涉降低Survivin穩(wěn)定性的結果。Pinl干涉后導致抗凋亡蛋白Survivin表達降低可能是Pinl干涉對阿霉素誘導的MCF-7細胞凋亡起增敏作用的原因之一。這一結果也提示Pinl可能通過增強腫瘤細胞抗凋亡蛋白Survivin的穩(wěn)定性來發(fā)揮抗凋亡作用。 綜上，通過對腫瘤細胞中Pinl的功能研

15、究發(fā)現(xiàn)：一方面，Pinl在順鉑引發(fā)的DNA損傷反應中通過抑制具有E3連接酶功能的Mdm2與p53的結合及其介導的泛素化降解，增強p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄激活下游凋亡相關基因的能力，促進順鉑誘導的腫瘤細胞凋亡。另一方面，在腫瘤細胞非應激狀態(tài)下Pinl又參與促進Mdm2與p53的結合及其介導的p53泛素化降解，對p53穩(wěn)定性發(fā)揮負調(diào)控作用。此外，干涉Pinl對阿霉素誘導的腫瘤細胞凋亡具有一定的增敏作用，其可能的機制是，干涉Pinl提高凋亡誘導蛋白