角膜真菌感染黏附分子機制的實驗研究.pdf

1、青島大學博士學位論文角膜真菌感染黏附分子機制的實驗研究姓名：潘曉晶申請學位級別：博士專業(yè)：眼科學指導教師：謝立信20090522制劑和真菌刺激的細胞作為空白對照，各組相互作用4 8 h ，對穿過M a t r i g e l 到達濾膜下方的人角膜上皮細胞進行H E 染色，拍照記錄并測定積分光密度，以評價真菌及其代謝產物對人角膜上皮細胞移行功能的影響，并進一步探討F A K 在上述過程中的作用。第三部分黏附相關蛋白在小鼠角膜真菌感染中的表

2、達選用近交系B A L B ／e 小鼠，應用角膜表層鏡法，即在小鼠角膜表面覆蓋大鼠角膜片，二者層間注入菌液( 1 0 6 C F U ) ，縫合眼瞼，建立三種常見致病真菌( 白色念珠菌、煙曲霉菌和茄病鐮刀菌) 的真菌性角膜炎動物模型。染料木黃酮處理組在角膜接種菌液前6 0 m i n ，環(huán)繞實驗眼角膜緣球結膜下注射F A K 特異性抑制劑染料木黃酮( 2 0 0 I _ t M ) 1 0 u l ，實驗組注射等量0 ．0 2 M P

3、B S 。裂隙燈顯微鏡觀察接種菌液后6 、1 2 、1 8 、2 4 和4 8 h 角膜病變特點，拍照記錄；應用H E 染色進行組織病理學觀察：應用免疫組織化學方法檢測以上各時間點L N 、I T 0 1 3 1 和F A K 蛋白的表達情況。結果：第一部分M T T 法檢測F A K 抑制劑( 染料木黃酮) 終濃度2 0 0 u M 是對細胞毒性較小的最大抑制濃度。細胞外基質( L N 、F N ) 、跨膜蛋白整合素I T G l 3

4、 1 ，以及F A K 信號通路中F A K 和P A X 基因均參與真菌與人角膜上皮細胞的黏附過程；F A K 信號轉導途徑在人角膜上皮細胞與真菌接觸后快速啟動并激活下游蛋白，應用抑制劑后信號蛋白表達均不同程度減低；免疫細胞化學觀察人角膜上皮細胞與真菌相互作用過程中L N 、F N 和F A K 表達均增強，其中F A K 表達呈強陽性；激光共聚焦顯微鏡顯示F N 定位于細胞外基質，F(xiàn) A K 和P A X 定位于細胞膜的內表面，并發(fā)

5、現(xiàn)真菌刺激后，細胞骨架發(fā)生明顯變化；流式細胞儀檢測結果提示真菌與I T G l 3 1 在瞬間迅速結合，染料木黃酮可明顯抑制P A X 表達；光學顯微鏡和積分光密度結果進一步證實了真菌黏附及染料木黃酮的抑制作用；電子顯微鏡觀察到真菌黏附后人角膜上皮細胞出現(xiàn)細胞器結構紊亂、胞膜邊緣波動和細胞內吞等超微結構的改變。第二部分利用T r a n s w e l l 小室成功構建三種常見致病真菌與人角膜上皮細胞相互作用的模型，接種真菌及其代謝產物