白血病干細胞靶向治療及耐藥逆轉.pdf

1、白血病治療中的耐藥、復發(fā)等問題，根本原因在于患者體內存在著一群白血病干細胞(LSC)。LSC在干細胞中所占比例極少，位于細胞克隆起始階段，和正常干細胞一樣能自我更新、具有分化潛能，但卻沒有正常干細胞的自我調控能力，在細胞到達分化末端前就已停止分化，功能紊亂的LSC大量增殖引發(fā)白血病。LSC95％以上處于G0期，呈休眠狀態(tài)，與目前化療藥物大多針對腫瘤細胞周期活躍期的作用機制沖突，同時發(fā)現(xiàn)與多藥耐藥密切相關的mdrl、BCRP和MRP基因在

2、LSC均高表達，這就揭示了LSC能成功逃逸化療并最終導致白血病復發(fā)的真正原因，也揭示了白血病治療的根本是在保證不損害正常造血干細胞功能的前提下定向清除患者體內的LSC。 基于以上理論本實驗從兩方面展開了針對LSC的治療研究： 1、對LSC表面特異性抗原的研究發(fā)現(xiàn)，白細胞介素3受體α鏈(IL-3Rα鏈)即CD123抗原，是特異識別并結合白細胞介素3(IL-3)的關鍵部位，在急性髓系白血病干細胞表面高表達，同時在正常造血干細

3、胞表面幾乎不表達，是探索根治急性髓系白血病的重要靶點。 力達霉素(LDM)是近年發(fā)現(xiàn)的具有強烈抗腫瘤能力的烯二炔類大分子蛋白毒素，由非共價鍵連接的活性發(fā)色團(LDE)和保護發(fā)色團的酸性蛋白(LDP)組成。且對mdrl高表達的多藥耐藥細胞株未表現(xiàn)出抗藥性，體內毒副作用小。 本實驗將IL-3與力達霉素酸性保護蛋白融合成IL3-G4S-LDP，研究其在大腸桿菌中的高效表達及表達產物與靶細胞結合的生物學活性，為體外組裝活性發(fā)色團

4、后靶向殺傷LSC奠定基礎。實驗采用PCR法擴增IL3和LDP的編碼DNA序列，經酶切、連接，克隆至表達載體pAYZ，轉化E.coli 16C9，經測序鑒定陽性克隆菌落插入片段可正確編碼849bp的融合蛋白。經低磷培養(yǎng)基AP5誘導表達融合蛋白，用CM-FF陽離子柱和抗-Etag親和層析柱純化，蛋白純度達95％以上，純化產物經SDS-PAGE和Westem blot鑒定，其表達形式主要為周質腔可溶性蛋白，表達量約為1mg/l。FACS測定融

5、合蛋白與CD123(+)靶細胞TF-1的結合活性，結合率接近99％。 2、PH Ⅱ-7是本室自主研發(fā)的氧化吲哚類抗腫瘤藥物，最大特點是抑制人多種來源、多種耐藥表型的耐藥腫瘤細胞生長，其中PH Ⅱ-7下調耐藥基因sorcin、mdr1的表達已被證實。這就提示PHⅡ-7很可能同樣下調MRP的表達，成為逆轉LSC MRP耐藥表型的良藥。且PH Ⅱ-7本身通過改變腫瘤細胞的周期分布兼具細胞毒性，具有很好的應用前景。 本實驗選用M

6、RP高表達、其他耐藥基因幾乎不表達的耐藥腫瘤細胞株HL60/ADR及其親代細胞系HL60為研究對象，MTT法檢測PHⅡ-7對阿霉素抗腫瘤活性的協(xié)同作用。HL-60組CDI值為0.7<1，HL-60/ADR組CDI值為0.43<0.7，PHⅡ-7對耐藥腫瘤細胞的協(xié)同作用顯著。提取不同濃度PHⅡ-7處理不同時間的HL-60和HL-60/ADR細胞mRNA，RT-PCR法分析PHⅡ-7對MRP基因表達水平的影響，發(fā)現(xiàn)PHⅡ-7能明顯下調腫瘤細

7、胞內MRP的表達水平，二者存在時間和劑量依賴關系。通過激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀觀察PHⅡ-7處理前后，HL-60和HL-60/ADR細胞內阿霉素的濃度，發(fā)現(xiàn)隨著PHⅡ-7作用時間延長，細胞內阿霉素濃度明顯提高，至96h時耐藥腫瘤細胞HL-60/ADR內的阿霉素濃度可從未經處理時僅為敏感細胞的22.4％升高到55％。以上結果充分驗證PHⅡ-7逆轉耐藥基因MRP表達的推測。 LSC的發(fā)現(xiàn)使研究者們認識了白血病發(fā)生發(fā)展、耐藥復發(fā)等