肝癌導向肽結合蛋白的篩選及其功能研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種分布范圍廣、危害嚴重的致死性疾病，我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，每年至少有12萬人死于原發(fā)性肝癌。然而在臨床上對肝癌目前尚缺乏根治性的治療方法，究其原因主要與我們對肝癌發(fā)生、發(fā)展的機理還知之甚少，對肝癌細胞具有的特殊生物學特性及其分子機理還有待于進一步深入研究。因此加強肝癌基礎理論的研究，提升有效的早期診斷和治療技術具有重要的理論意義和實際應用價值。 本實驗的前期工作是利用噬菌體展示肽庫技術篩選與肝癌特異性結合的導向肽，已

2、經建立了多種篩選方法，尤其是在荷瘤動物模型中的體內篩選技術，同時建立了一套腫瘤特異性導向肽在體內外靶向作用的鑒定技術。目前已經篩選獲得了多條特異性結合于肝癌組織的導向肽，并獲得了中國發(fā)明專利。本論文在此基礎上，擬利用獲得的三種肝癌細胞特異性導向肽(A54、WP05和JY96)，通過固相生物淘洗和免疫學技術從己構建的肝癌cDNA表達文庫中篩選出這些導向肽的結合蛋白基因，并分析這些基因與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的聯(lián)系，同時通過親和分離技術從肝癌組

3、織蛋白提取液中分離與這些導向肽相互作用的結合蛋白。 本論文主要分成以下幾個部分： 一、肝癌導向肽的體外結合活性鑒定在前期工作中我們篩選獲得了一系列能夠特異性結合肝癌細胞的噬菌體肽，然而體外化學合成的肽是否還能保持這一導向特性還需要進一步驗證。我們采用化學合成的方法合成了多肽WP05、JY96和A54，并對其進行羧基熒光素(FAM)標記，通過體外結合活性來驗證這些導向肽與肝癌細胞的特異性結合作用。經驗證，化學合成的WP05

4、、JY96和A54肽確實能在體外與肝癌細胞特異性結合，為分離導向肽在肝癌細胞上的結合蛋白奠定了理論基礎。 二、肝癌cDNA表達文庫的構建及肝癌導向肽結合蛋白基因的篩選通過cDNA表達文庫篩選策略分離肝癌特異性導向肽WP05、JY96和A54的結合蛋白基因。以人肝癌細胞BEL-7402的裸鼠移植瘤為材料，構建了肝癌cDNA表達文庫，原始文庫滴度為6.1×10<'7>pfu/ml，重組率99.3％，擴增后滴度1.4x10<'11>p

5、fu/ml，達到了用于目的基因分離篩選和克隆表達的建庫要求。以生物素(Biotin)標記的導向肽為探針，同時采用固相篩淘法和免疫學方法篩選cDNA文庫。實驗結果顯示：利用導向肽WP05從文庫中篩選到了SNX27基因；利用導向肽JY96篩選到RBXl基因。三、siRNA抑制SNX27基因表達對肝癌細胞的影響SNX27是通過導向肽WP05從肝癌cDNA表達文庫中篩選到的基因。SNX27基因在肝癌細胞內上調表達，因此我們通過RNA干擾技術分析

6、SNX27基因與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的相互關系。RNA干擾采用siRNA真核表達載體的方法誘導。通過在線siRNA設計工具設計SNX27基因干擾靶序列，利用pAS質粒構建siRNA真核表達載體pAS/SNX27i。通過轉染試劑將pAS/SNX27i轉染到BEL-7402細胞中，分析RNA干擾抑制效率，分別檢驗了SNX27基因表達被抑制的腫瘤細胞在增殖、粘附和遷移的變化。結果表明，轉染后SNX27基因的表達抑制效率達到了29-5％。SNX2

7、7表達抑制導致腫瘤細胞發(fā)生如下變化：增殖速率顯著下降；細胞粘附性下降，與對照細胞相比差異極顯著(P=0.00084<0.005)；細胞遷移性下降，與對照細胞相比差異顯著(0.05>P=0.0016>0.001)。四、siRNA抑制RBXl基因表達對肝癌細胞的影響RBXl是通過導向肽JY96從肝癌cDNA表達文庫中篩選到的基因。經差異表達分析，RBXl在肝癌細胞BEL-7402中呈上調表達，提示其可能與肝癌有一定聯(lián)系。構建RBXl基因的s

8、iRNA真核表達載體pAS/RBXli，通過轉染試劑將pAS/RBXli轉染到BEL-7402細胞中，檢驗RBXl基因表達被抑制的腫瘤細胞增殖、粘附和遷移的變化。結果表明，轉染后RBXl基因的表達抑制效率達到了68.6％。RBXl表達抑制導致腫瘤細胞發(fā)生如下變化：增殖幾乎完全停滯；細胞粘附性下降，與對照相比差異極顯著(P=0.0003<0.005)；細胞遷移性下降，與對照相比差異極顯著(P=0.0007<0.005)。 四、肝癌

9、蛋白的提取及肝癌導向肽結合蛋白的親和分離為分離得到肝癌導向肽A54的結合蛋白，我們嘗試從肝癌組織蛋白中用親和分離技術獲得A54肽的結合蛋白。從荷瘤裸鼠模型腫瘤組織中提取肝癌組織蛋白。以Biotin-A54肽作為親和分離介質，通過多種親和分離技術從提取的肝癌組織蛋白中獲得能與A54肽相互作用的結合蛋白。經對洗脫蛋白的質譜進行分析，發(fā)現洗脫蛋白為分子量為67kDa的一組蛋白，其中包括已有報導的潛在腫瘤膜標志蛋白HSC71。經生物信息學分析，

10、HSC71蛋白具有能與A54肽相互作用的空間結構。從上面的實驗我們可以得到以下結論： 1．通過體外的細胞結合實驗，證明了導向肽WP05、JY96和A54能夠與肝癌細胞特異性結合； 2．成功構建了人肝癌細胞裸鼠移植瘤的cDNA表達文庫，達到了用于目的基因分離篩選和克隆表達的建庫要求； 3．利用導向肽WP05從cDNA表達文庫中篩選到SNX27基因； 4．利用導向肽JY96從cDNA表達文庫中篩選到RBXl基

11、因； 5．成功構建了SNX27基因siRNA真核表達載體pAS/SNX27i，轉染BEL-7402細胞后，對SNX27基因表達抑制效率達到29.5％，能夠抑制腫瘤細胞增殖、粘附及其遷移。 6．成功構建了RBX1基因siRNA真核表達載體pAS/RBXli，轉染BEL-7402細胞后，對RBX1基因表達抑制效率達到68.6％，能夠抑制腫瘤細胞增殖、粘附及其遷移。 7．嘗試通過親和分離方法分離導向肽A54的結合蛋白，