木豆葉神經細胞保護物質基礎和作用機制研究.pdf

1、現(xiàn)代研究表明神經細胞保護是防治神經退行性疾病，如老年性癡呆、重癥抑郁癥、帕金森癥和中風等疾病的重要機制。豆科木豆屬植物木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]的葉子作為傳統(tǒng)藥物在民間被廣泛使用，近年來發(fā)現(xiàn)其提取物具有抗Aβ25-35誘導小鼠學習記障礙及對海馬神經細胞損傷具有保護活性。但是，其神經細胞保護的活性成分和作用機制并不清楚。本文將在活性指導下，對木豆葉神經細胞保護活性成分進行分離，并對活性強的化合物進行深入的機制

2、研究。
　　首先，制備了木豆葉醇提取物的不同部位，并進行抗皮質酮誘導PC12細胞損傷的活性篩選，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的四個部位均在不同程度上表現(xiàn)出抗皮質酮誘導損傷的神經保護活性，但脂溶性部分在較低濃度時即表現(xiàn)較強的活性，提示著木豆葉醇提取在低極性部分具有較強的活性化合物。隨后，利用各種分離色譜技術及光譜技術從木豆葉活性部位中分離并鑒定23個化合物，其中黃酮類化合物9個、芪類化合物4個和其他化合物10個。它們結構分別是木豆素(Cajanin

3、stilbeneacid)、木豆素A(Longistylin A)、木豆素C（Longistylin C）、木豆內酯A(CajanolactoneA)、球松素(Pinostrobin)、葒草苷(Orientin)、異牡荊苷(Isovitexin)、牡荊苷(Vitexin)、Cajanol、Cajanin、櫻黃素(Prunetin)、紅車軸草素(Pratensein)、(2R，3R)-2，3-二氫-5-7，4'-二甲氧基黃酮(2R，3R-

4、2，3-dihydro-5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavone)、10'，16'-二羥基棕櫚酸乙酯(Ethyl10'，16'-dihydroxy hexadecanoate)、香草酸(Vanillic acid)、十七烷酸乙酯(Ethyl heptadecanoate)、2-O-甲基肌醇(2-Oquebrachitol)、2，3，4-三羥基異戊酸(2，3，4-trihydroxy-isovaleric acid)

5、、豆甾醇(Stigmasterol)、樺木酸(Betulinic acid)、十七烷酸(Heptadecanoic acid)、β-谷甾醇(β-sitosterol)和β-胡蘿卜苷(β-daucosterol)。
　　為了進一步明確木豆葉中化學成分，運用UPLC-QTof-MS技術對木豆葉乙醇提取物定性分析，鑒定出18個化合物，黃酮類14個，芪類4個。4個芪類化合物均分離得到，有8個黃酮類化合物是未分離得到，它們的結構是:槲皮苷(

6、Quercitrin)、刺苞菊甙(Carlinoside)、異槲皮苷(Isoquercitrin)、蘆丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、芹黃素(Apigenin)和Cajaflavanone。從UPLC-QTof-MS分析結果表明，芪類和黃酮類成分是木豆葉中的主要成分，芪類化合物主要苷元存在，未發(fā)現(xiàn)糖苷;黃酮類化合物苷元和苷均有發(fā)現(xiàn)。
　　在完成化合物分離的基礎上，建立PC12細胞的皮質

7、酮損傷、谷氨酸損傷和過氧化氫損傷三個模型，對8個主要化合物（四個黃酮化合物:牡荊苷、葒草苷、球松素、Cajanol;四個芪類化合物:木豆素、木豆素A、木豆素C和木豆內酯A）進行細胞保護活性篩選，結果表明8個化合物均在不同程度上具有一定的神經細胞保護活性，但是芪類體現(xiàn)出較強的保護活性。木豆素和木豆素C分別對皮質酮和谷氨酸誘導的PC12細胞損傷具有較強的保護活性。
　　為了探討木豆芪的神經細胞保護活性與其抗氧化之間的關系，本文采用體外

8、抗氧化評價法（化學評價和細胞學評價）對芪類化合物的抗氧化活性進行測定。化學評價表明木豆素具有較強的自由基清除活性，而木豆素A具有較強的還原活性。細胞學評價表明四個茋類化合物具有不同程度的抗氧化活性，木豆素能夠最大程度地降低細胞內ROS和MDA的含量，增加細胞中SOD和CAT的活性，木豆素A次之。該實驗表明木豆芪抗氧化的化學評價和生物學評價具有一定的相關性。為了闡明木豆芪神經損傷保護的可能機制，本文選擇木豆素和木豆素C分別進行抗皮質酮和抗

9、谷氨酸誘導的PC12細胞損傷的機制研究。
　　通過MTT（甲基噻唑基四唑）法、LDH釋放、Hoechst33342染色法和流式細胞凋亡檢測等藥效學方法，證明Longistylin C具有顯著的抗谷氨酸神經細胞保護的活性。作用機理表明， Longistylin C能夠明顯下調由高濃度谷氨酸過度激活的天門冬氨酸受體（NMDAR/NR2B）和鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)，上調磷酸化細胞外信號調控激酶1和2(p-ERK1/2

10、)、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(p-CREB)。降低細胞內的鈣離子濃度和ROS濃度、下調內質網(wǎng)伴侶分子糖調節(jié)蛋白78（GRP78）、轉錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP/GADD153)、細胞核轉錄因子X盒結合蛋白抗體(XBP-1)、Caspase-12和Caspase-9，從而緩解由谷氨酸興奮性毒性誘導的氧化應激和內質網(wǎng)應激。同時，通過逆轉線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)的異常開放和線粒體膜電位(MMP)的去極化，下調細胞胞質中的

11、細胞色素C、Caspase-3和ICAD，在一定程度上恢復線粒體的功能，從而抗谷氨酸誘導的PC12細胞凋亡。
　　通過MTT法、LDH釋放、Hoechst33342-PI雙染法和流式細胞凋亡檢測等藥效學方法，證明CSA具有顯著的抗皮質酮神經細胞保護活性。機制研究表明，CSA能夠作為組蛋白去乙?；?HDAC-6)的抑制劑，下調細胞中過多的HDAC-6表達，從而導致熱休克蛋白90(HSP90)乙酰化后，脫離其輔酶因子，與糖皮質激素受

12、體(GR)的親和力降低，從而間接下調GR表達。另一方面發(fā)現(xiàn)，CSA具有雌激素樣作用，能夠與雌激素受體(ER)結合而激活MAPK通路，通過上調磷酸化分裂原活化抑制劑(p-MEK)、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)和磷酸化反應元件結合蛋白(p-CREB)參與調節(jié)神經元和突觸的可塑性;同時上調磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化促凋亡蛋白(p-Bad)而激活線粒體抗凋亡途徑。此外，通過降低細胞內的鈣離子濃度，而緩解凋亡通路

13、下游的氧化應激和內質網(wǎng)應激。
　　本文通過神經細胞保護活性指導下的化學分離、活性篩選及機制的研究，發(fā)現(xiàn)木豆葉醇提物中的神經保護活性化合物主要是木豆芪類;其作用機制主要通過抑制下游的氧化應激、內質網(wǎng)應激、恢復線粒體功能，以及調節(jié)上游受體靶點，達到抗細胞凋亡。
　　此外，本論文還對神經細胞的主要凋亡機制和損傷模型及木豆葉化學成分和藥理活性研究進展進行了綜述。本文研究為尋找神經細胞保護的活性化合物或先導化合物提供了科學的依據(jù)，亦為