體外重建外泌汗腺的初步研究.pdf

1、目的：1、體外培養(yǎng)的汗腺腺上皮細胞分別接種在Matrigel下表面、上表面、以及Matrigel中，探討以Matrigel為主要基質構建汗腺樣結構的方法。2、對已構建的汗腺樣結構進行鑒定，探討其在形態(tài)學、組織學上與正常汗腺的相似性。3、通過對鈣離子激動劑和阻滯劑對體外重建的汗腺樣結構鈣通道的影響作用的研究，探討其在功能上與正常汗腺的相似性。 方法：1、將酶消化法分離培養(yǎng)的原代汗腺腺上皮細胞分別接種在Matrigel下表面、上表面

2、以及Matrigel中，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況。2、用倒置相差顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、計算機三維重建、電鏡、HE染色及免疫組織化學法觀察汗腺樣結構的形態(tài)學及組織學特性。3、鈣熒光探針Fluo-3對汗腺樣結構染色，分別在汗腺樣結構中適時加入鈣離子激動劑(氯化乙酰膽堿)和阻滯劑(阿托品)，激光共聚焦顯微鏡觀察其細胞內游離鈣離子濃度變化情況。 結果：1、汗腺腺上皮細胞接種在Matrigel下表面，立體培養(yǎng)11d形成腔

3、面結構，但細胞增殖不明顯；當接種在Matrigel上表面時，立體培養(yǎng)8h，細胞胞漿伸長呈絲狀，與鄰近細胞相連呈腔面或半腔面形；而接種在Matrigel中，三維立體培養(yǎng)2~3d，細胞分裂增生，增生細胞彼此緊密排列成立體管腔結構，中間可見明顯腔隙，隨新生細胞增多，管腔結構逐漸演變?yōu)椴灰?guī)則球形結構。2、激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示細胞團呈球形結構，中央有管腔結構，細胞排列富有極性。計算機軟件三維重建后從不同角度觀察，細胞團呈不規(guī)則球形結構。透射

4、電鏡下可見含有大量高電子致密度顆粒的細胞，以及相對含有較少高電子致密度顆粒、但含有較多線粒體的細胞；細胞彼此排列形成管腔結構，其連接處可見指狀突起以及類似分泌小管的腔隙。球形結構HE染色示其剖面為單層細胞相互連接形成環(huán)狀結構，中間見明顯的腔隙，細胞呈錐形，胞質嗜酸性，淡染，胞核藍染，稍大，偏向基底部。免疫組織化學染色示CK18、CEA表達陽性。3、細胞外液鈣濃度高時，加入氯化乙酰膽堿后，鈣通道開放，細胞外鈣內流，細胞內鈣濃度明顯增加；細