性激素替代療法的實驗研究.pdf

1、雌激素是維持女性生理和心理健康所必需的內(nèi)源性活性物質(zhì)，自絕經(jīng)期開始至絕經(jīng)后，伴隨著刺激素水平的降低，女性出現(xiàn)一系列的絕經(jīng)近期、中期和遠期的相關疾病。因而，雌激素補充治療成為女性健康醫(yī)療服務的一個重要領域。但是雌激素有促使子宮內(nèi)膜增生而致癌的不良反應，所以目前主要采用雌、孕激素聯(lián)合應用的性激素替代療法(Hormone Replacement Therapy，HRT)。但是HRT仍然存在一些不良作用，孕激素不能完全糾正雌激素的副作用，而且削

2、弱雌激素對心血管的保護作用。新的治療方案在不斷探索中。雷洛昔芬是一種選擇性的雌激素受體拮抗劑，對乳腺、子宮組織顯示為雌激素的受體拮抗劑，對骨骼和血脂則為雌激素受體的激動劑，對心血管系統(tǒng)目前也發(fā)現(xiàn)多種類雌激素的作用?？梢酝茰y，兩者聯(lián)用后的有利作用可以得到增強，而二者的副作用則可以相互削減。 目前，有關新的HRT方案的研究不多，用雷洛昔芬代替孕激素的方法還沒有報道。本文應用雷洛昔芬替代孕激素，輔以阿司匹林，觀察其對血管平滑肌細胞的

3、增殖以及ICAM-1、PAI-1、ET-1在血管內(nèi)皮細胞中的表達的影響，從細胞和分子水平對該方案能否達到預期效果進行深入研究。 第一部分阿司匹林抑制血管平滑肌細胞增殖及相關機制 方法： 1.MTT法檢測對血管平滑肌增殖的抑制作用將對數(shù)生長期的細胞以每孔10<'4>個種于96孔板中，待其長至80﹪融合，換用不含血清和酚紅的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時，使細胞同步于G<,0>期，然后換用2﹪FCS的：DMEM，加入阿

4、司匹林，使終濃度分別為10<'-4>4mol/L、10<'-3>3mol/L、2×10<'-3>mol/L、5×10<'-3>mol/L四個處理組，并設對照組。培養(yǎng)24小時后，每孔加入MTT(0.5/L)20ul孵育4小時，吸去上部液體，然后加入二甲基亞砜(DMSO)150ul，輕微震蕩10min使沉淀完全溶解，用酶標儀在570nm波長處測定吸光度。觀察阿司匹林對血管平滑肌細胞的增殖的抑制作用。 2．免疫細胞化學檢測阿司匹林處理

5、后平滑肌細胞中PCNA表達用VSMC制作細胞爬片，將對數(shù)生長期細胞以每孔10<'5>個接種于6孔板中，蓋玻片預先放置在6孔板中，待長至80﹪融合時用無血清無酚紅DMEM靜止24小時，換含2﹪FCS的DMEM，加入阿司匹林，分組同上。24小時后，移去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，4﹪多聚甲醛固定，PBS洗3次，用試劑盒中的山羊血清室溫孵育30min，加一抗置濕盒中4℃孵育12小時，然后按照試劑盒說明書加二抗，顯色，復染。在100倍視野下隨機選取

6、細胞爬片上不同部位的5個視野，計數(shù)陽性細胞。用x<'2>檢驗、Fisher’s精確概率法進行統(tǒng)計分析。P<0.05被認為有顯著性差異。 3．流式細胞檢測阿司匹林作用后血管平滑肌細胞周期變化細胞按10<'5>個細胞每孔轉(zhuǎn)入6孔L板培養(yǎng)至80﹪融合，更換為無血清培養(yǎng)基孵育24h使細胞同步，隨后將細胞置于含2﹪FCS培養(yǎng)基中，并加入不同劑量阿司匹林(分組為10<'-3>mol/L、2×10<'-3>mol/L、5×10<'-3>mo

7、l/L三個處理組和對照組)，繼續(xù)孵育24h，收獲細胞(約10<'6>個)，70﹪乙醇固定，4℃過夜，溴化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測細胞周期。Modtif軟件分析細胞周期。 4．RT-PCR檢測阿司匹林作用后PCNA mRNA表達變化細胞經(jīng)不同濃度阿司匹林(分組同上)處理24小時后，用Trizol提取總RNA，具體操作步驟按照說明書。用紫外分光光度法測定RNA純度和濃度。本實驗測定PCNA mRNA表達，用β-actin作為

8、內(nèi)參。按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，PCNA和β-actirin同管在50ul反應體系中進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物在含0.5ug，ul EB的1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-rad)對條帶進行半定量分析，PCNA基因的表達量通過擴增的β-actin的表達進行校正，即以PCNA/β-actin比值作為PCNA基因表達相對水平．統(tǒng)計學處理：每個樣本重復測定3次，實驗結(jié)果以均數(shù)士標準差(X±s)表示，采用SPSS

9、10.0統(tǒng)計軟件包進行配對t檢驗、方差分析、x<'2>檢驗進行統(tǒng)計學處理。 結(jié)果： 1.MTT實驗檢測顯示阿司匹林能明顯抑制血管平滑肌細胞的增殖活性，在各濃度的生長抑制率分別為4.9﹪、15.5﹪、16.2﹪、31.5﹪。 2.免疫細胞化學顯示5×10<'-3>mol/L，阿司匹林處理組染色較淺，而對照組和10<'-3>mol/L、2×10<'-3>mol/L組染色深。軟件檢測后結(jié)果顯示5×10<'-3>mol

10、/L組PCNA表達明顯低于正常對照組(P<0.05)，而10<'-3>mol/L、2×10<'-3>mol/L，組和對照組間沒有明顯差異(P>0.05). 3.流式細胞結(jié)果表明5×10<'-3>mol/L阿司匹林處理后，血管平滑肌細胞增殖主要阻滯在S期。 4.5×10<'-3>mol/L阿司匹林處理后，血管平滑肌細胞內(nèi)PCNA mRNA表達較對照組低。而10<'-3>mol/L和2×10<'-3>mol/L濃度和對照組間

11、沒有明顯差異。 結(jié)論： 本文證明較高濃度的阿司匹林能抑制血管平滑肌細胞的增殖和核內(nèi)PCNA的表達，提示這種抑制作用可能是通過抑制PCNA的表達，從而使血管平滑肌細胞的增殖停滯在S期。阿司匹林抑制PCNA表達最早可能在mRNA水平。 第二部分單一藥物對血管內(nèi)皮細胞ET-1、PAI-1、ICAM-1基因表達的影響 方法：將對數(shù)生長期細胞以每孔10<'5>個接種于6孔板中，待其長至70-80﹪融合，換含1﹪

12、血清無酚紅的培養(yǎng)液培養(yǎng)。加入藥物，培養(yǎng)24小時后取出細胞，按Tizol說明書提取RNA，做逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測雌激素，雷洛昔芬，阿司匹林處理后，ET-1、PAI-1、ICAM-1在內(nèi)皮細胞中的表達情況。 三種藥物的實驗分組情況分別為：阿司匹林：5×10<'-3>mol/L，2×10<'-3>mol/L，10<'-3>mol/L，對照組雌激素：10<'-9>mol/L，10<'-8>mol/L，10<'-7>mol/L，對照組。雷洛

13、昔芬：10<'-8>mol/L，10<'-7>mol/L，10<'-6>mol/L，對照組。 結(jié)果：5×10<'-3>mol/L阿司匹林能抑制PAI-1基因表達10<'-7>mol/L和10<'-6>mol/L雌激素可以抑制內(nèi)皮細胞中ET-1基因的表達10<'-6>mol/L雷洛昔芬可以抑制ICAM-1和ET-1基因的表達。 結(jié)論：較高濃度的雌激素和雷洛昔芬可以抑制ET-1表達，阿司匹林可以抑制PAI-1表達，而這兩個內(nèi)