抑制性消減雜交技術克隆腎細胞癌轉移相關基因.pdf

1、腎細胞癌(RCC)是泌尿系常見惡性腫瘤，其發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3％，全世界的發(fā)病率每年遞增2％，死亡人數逐年上升。腎癌的主要治療方法是外科手術，化療、放療、激素治療均不敏感，尤其是晚期腎癌的治療效果不容樂觀。因此，如何實現(xiàn)腎細胞癌的早期診斷、早期治療成為我們在臨床工作中需要迫切解決的問題。抑制性消減雜交(SSH)是以消減雜交為基礎結合抑制性PCR建立起來的分離克隆差異表達基因的方法，是近年發(fā)展起來的篩選、克隆差異表達基因的一種有效手段

2、。 我們采用抑制性消減雜交(SSH)技術構建高侵襲性腎癌細胞和低侵襲性腎癌細胞差異表達的cDNA消減文庫，初步篩選并克隆腎細胞癌轉移相關基因，為建立一套檢測腎細胞癌轉移的生物學標志和治療的新靶點奠定了基礎。 目的：構建高侵襲性腎癌細胞和低侵襲性腎癌細胞差異表達基因的cDNA消減文庫，篩選并克隆腎細胞癌轉移相關基因； 　　方法：以高侵襲性腎癌細胞和低侵襲性腎癌細胞為研究對象，進行抑制性消減雜交分析：分別提取細胞To

3、tal RNA，合成雙鏈cDNA，經RsaI酶切后將高侵襲性腎癌細胞cDNA分為兩組并加上不同的接頭，再與過量低侵襲性腎癌細胞cDNA進行兩次消減雜交及兩次抑制性PCR，將PCR產物與T/A載體連接并轉化大腸桿菌構建構建cDNA消減文庫，以菌液PCR的方法檢測隨機挑選的陽性克隆，送檢測序，利用BLAST軟件進行同源性分析，半定量RT-PCR方法檢測腎細胞癌轉移相關基因在腎癌原發(fā)組織和轉移組織中的差異表達； 結果：成功構建高侵襲性