復合GDNF和VEGF質粒的異體脫細胞神經支架對大鼠坐骨神經缺損的修復作用.pdf

1、本研究擬通過化學萃取獲得脫細胞的大鼠同種異體神經支架，復合上編碼膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicgrowthfactor,GDNF)和血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因的真核表達質粒，構建一種具有生物活性的人工神經復合體并研究其在修復大鼠坐骨神經缺損中的作用，為探索自體神經移植的替代方法提供理論和實驗依據(jù)。

2、第一部分大鼠脫細胞同種異體神經支架的構建。 目的：構建大鼠脫細胞同種異體神經支架。 方法：健康雌性SD大鼠50只，體重在450g-500g之間作為供體。 采用Triton-X1.00和脫氧膽酸鈉通過低滲-脫細胞的組織工程學方法來處理新鮮大鼠坐骨神經。鈷一60γ射線輻照消毒滅菌后，通過大體觀察、光鏡觀察、掃描電鏡觀察評價其組織形態(tài)。4只Wistar大鼠作為受體行體內橋接實驗，術后3天，4周取支架作石蠟切片，HE染色

3、；3只Wistar大鼠作為受體行背部肌肉包埋實驗，術后1周取支架作石蠟切片，HE染色；評價細胞相容性和組織相容性。 結果：經過化學萃取后支架呈半透明狀，較新鮮神經略有收縮。光鏡觀察、掃描電鏡觀察均未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞成分殘留，僅剩下較完整的基底膜管道。肌肉包埋實驗后1周支架周圍有輕微的炎癥反應，周圍肌肉無明顯壞死。體內橋接實驗發(fā)現(xiàn)術后3天雪旺細胞即可長入支架，4周后空的基底膜管可被細胞充填，支架內外無明顯炎癥反應。 第二部分

4、復合G1)NF、VEGl*質粒的脫git胞神經支架對神經元的保護作用 目的：評價用復合GDNF、VEGF質粒的脫細胞神經支架橋接神經缺損時對脊髓前角運動神經元的保護作用。 方法：125只Wistar大鼠隨機分為5組，梨狀肌下切除10mm坐骨神經制備神經缺損模型。A組用第一部分制備的脫細胞神經支架修復，再注射101xl(5μg)pcDNA-GDNF-GFP質粒，1Oμl質粒包埋液，10／xl載體轉染液，20μl雙蒸水入支架

5、構建成具有生物活性的人工神經，即基因活化的細胞外基質(GAM)。B組用10μl(5μg)pDsVEGFl65Redl-N1質粒，其余同A組；C組用5μl(2．5gg)pcDNA-GDNF-GFP質粒+5itl(2．5gg)pDsVEGFl65Redl-N1質粒，其余同A組；D組僅用脫細胞神經支架修復；E組用自體神經掉轉180度修復。術后3天，1周，4周，12周取支架，L4-L5脊髓，作激光共聚焦顯微鏡觀察；作脊髓組織中GDNF、VEGF

6、的RT-PCR檢查；作GDNF、VEGF、iNOS(induciblenitricoxidesynthase)免疫組化觀察；脊髓標本再作尼氏染色，計數(shù)雙側前角運動神經元的數(shù)目，求出神經元的恢復率。 結果：術后3天，A、B、C組的支架和脊髓中即可見到相應的熒光表達，術后l周表達最強，至術后12周仍有較強表達。免疫組化顯示術后3天，各組中即有GDNF陽性細胞，A、C組表達最強，術后12周仍可檢測出；VEGF陽性細胞在B、C組的表達最

7、強，術后12周也可檢測出；GDNF或VEGF陽性細胞在支架中主要是雪旺細胞和巨噬細胞和部分炎癥細胞，在脊髓中主要是神經元和膠質細胞。RT-PCR分析顯示A組脊髓中GDNFmRNA的表達水平在術后3天即明顯上調，術后l周最強，12周仍可檢測到；B組脊髓中VEGFmRNA在在術后3天也明顯上調，術后1周最強，12周仍可檢測到。iNOS免疫組化結果顯示C組術后2周iNOS表達低于D組，與E組沒有顯著性差異。尼氏染色結果顯示C組神經元的恢復率高

8、于D組，與E組沒有顯著性差異。 第三部分復合GDNF、VEGF質粒的脫細胞神經支架對再生軸突的作用 目的：評價用復合GDNF、VEGF質粒的脫細胞神經支架橋接神經缺損時對再生軸突數(shù)量和質量的影響。 方法：術后12周取支架、支架遠近端的神經組織，作石蠟切片，HE染色，計數(shù)遠近端的再生軸突數(shù)、再生軸突相對面積。取遠端的神經組織，作超薄切片，透射電鏡觀察，計算髓鞘厚度、相對髓鞘面積、相對神經組織面積。作墨汁灌注后計算支

9、架內再生血管的相對面積。 結果：術后12周支架近端的再生軸突數(shù)在各組間沒有顯著性差異，但在遠端，A、B、C3組間沒有顯著性差異，但高于D組，低于E組，有顯著性差異。超微結構觀察中，C組再生髓鞘、軸突等相關指標優(yōu)于A、B、D組，但較E組差，差異均有顯著性。術后12周B、C組支架中再生血管的指標均優(yōu)于A、D組，但較E組差，差異均有顯著性。 第四部分復合GDNF、VIEGF質粒的脫細胞神經支架對再生神經功能恢復的影響

10、目的：評價用復合GDNF、VEGF質粒的脫細胞神經支架橋接神經缺損時對再生神經功能恢復的影響。 方法：術后12周通過電生理檢查了解再生神經的傳導功能。取雙側腓腸肌，測量其濕重恢復率和面積恢復率，并作氯化金染色觀察運動終板形態(tài)。同時行步態(tài)分析，測量坐骨神經指數(shù)。 結果：C組的電生理檢測指標、腓腸肌濕重和面積恢復率、坐骨神經指數(shù)均明顯優(yōu)于A、B組，但較E組差，差異有顯著性。 第五部f1．復合GI)Ⅻ、VIEGF質粒的

11、脫細胞神經支架在體內實驗中的安全性分析 目的：評價用復合GDNF、VEGF質粒的脫細胞神經支架修復周圍神經后目的基因對遠處器官的影響。 方法：術后12周，A組，B組各3只大鼠取心，肝，腎，脾作RT-PCR檢測。另取一小塊組織，作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。 結果：術后12周，A、B組心，肝，腎，脾組織的RT-PCR檢測均沒有發(fā)現(xiàn)目的基因的表達。心，肝，腎，脾組織沒有發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥細胞侵潤，組織形態(tài)，結構正常，

12、沒有發(fā)現(xiàn)明顯的癌變組織。 結論 1．低滲．脫細胞的組織工程學方法處理新鮮大鼠坐骨神經，可以獲得脫細胞的同種異體神經支架，具有一般神經組織的天然孔隙和三維結構，材料的免疫原性基本被去除，具有良好的細胞相容性和組織相容性。 2．脫細胞同種異體神經可以在體內通過多聚賴氨酸與pcDNA3．0-GDNF-GFP和pDsVEGFl65Redl—N1真核表達質粒復合成具有生物活性的神經支架——GDNF-VEGF基因活化的細胞外

13、基質。 3．術后1周GAM中的GDNF和VEGFl65質粒DNA在創(chuàng)傷局部達到轉染高峰．并且可隨軸突逆行轉染脊髓中的神經元和膠質細胞，持續(xù)表達相應的蛋白質至少12周；轉染不僅有緩釋作用，還有特異性和時效性。 4．GDNF-VEGF-GAM可以促進周圍神經損傷后神經細胞和膠質細胞的陽性表達，保護神經元的數(shù)量和功能，其機制可能與抑制凋亡通路有關。 5．GDNF-VEGF-GAM可以提高再生軸突的數(shù)量和功能。