HIF-1α和細胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達和意義.pdf

1、目的：本實驗通過建立大鼠低壓缺氧損傷模型，采用RT-PCR和免疫熒光組織化學技術，研究低壓缺氧性腦損傷后缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和細胞紅蛋白(Cygb)在腦組織海馬區(qū)的表達部位及時序性變化特點，探討它們之間的相互關系以及在低壓缺氧性腦損傷中的作用。 方法：選用清潔級成年雄性SD大鼠60只，體重280～320克。隨機分為對照組及低壓缺氧6h、12h、18h和24h組。建立大鼠低壓缺氧損傷模型：H.E、甲苯胺蘭染色觀察腦組

2、織形態(tài)學改變；物理方法檢測腦含水量；生化手段檢測腦組織SOD、CAT、NOS活性及MDA、NO含量。應用RT-PCR技術檢測大鼠腦海馬區(qū)HIF-1α和Cygb mRNA表達水平。采用免疫熒光雙標記技術，利用激光共聚焦顯微鏡，觀察低壓缺氧腦損傷后HIF-1 α和Cygb在大鼠海馬各區(qū)神經細胞中的定位及時序性變化特點。 結果： 1. 低壓缺氧損傷后腦組織形態(tài)學改變：腦冠狀切片H.E染色可見海馬CA1區(qū)對低壓缺氧最為敏感。低壓

3、缺氧6h組CA1區(qū)大部分神經細胞胞體縮小，胞核固縮，核仁消失，胞漿深染，同質性嗜酸性著色(紅色神經細胞)；海馬CA2、CA3、CA4區(qū)以細胞水腫為主，神經細胞胞體腫脹，胞漿不規(guī)則淡染，胞核腫大淡染或消失。低壓缺氧12h、18h和24h組海馬各區(qū)細胞均以壞死和凋亡為主；隨低壓缺氧時間的延長損傷逐漸加重。可見大部分細胞皺縮變形，胞漿深染，核碎裂及核溶解，間質中充滿細胞碎片和凋亡小體。對照組甲苯胺蘭染色后神經細胞胞核呈淡藍色，胞漿可見大量深藍

4、色粗顆粒狀Nissl體。各低壓缺氧組H.E染色中所見的紅色神經細胞，甲苯胺蘭染色呈均一深藍色，Nissl體消失；H.E染色胞體腫脹、胞漿淡染細胞，甲苯胺蘭染色整個細胞呈淡藍色，Nissl體減少或消失。 2. 腦含水量檢測結果：各低壓缺氧組腦含水量隨低壓缺氧時間的延長而逐漸增加，與對照組相比均有顯著差異(P<0.01)。 3. 生化指標檢測結果：各低壓缺氧組腦組織中SOD、CAT活性隨低壓缺氧時間的延長而逐漸降低，與對照組

5、相比均有顯著差異(P<0.01)；與對照組相比，各低壓缺氧組腦組織NOS活性均明顯升高(P<0.01)。與對照組相比，低壓缺氧12h組MDA含量才出現(xiàn)明顯增加(P<0.05)；18h、24h組MDA含量顯著增加(P<0.01)，隨低壓缺氧時間的延長呈逐漸增加趨勢。與對照組相比，NO含量也隨低壓缺氧時間的延長逐漸增加，除低壓缺氧6h組外，其余各組NO含量均與對照組有顯著差異(P<0.01)。 4. RT-PCR結果： (1

6、)HIF-1 α：對照組中HIF-1α無表達，低壓缺氧損傷后出現(xiàn)表達并隨時間的延長逐漸增高，表現(xiàn)出時間依賴特點。各低壓缺氧組與對照組相比均有顯著差異(P<0.01)。 (2)Cygb:對照組Cygb呈低表達；與對照組相比，低壓缺氧6h組(P<0.05)和12h、18h、24h組(P<0.01)Cygb表達量均顯著增加，并表現(xiàn)出時間依賴特點。 5. 免疫熒光組織化學染色結果：HIF-1α免疫熒光陽性細胞呈綠色熒光，Cygb

7、免疫熒光陽性細胞呈紅色熒光，兩者共定位顯示黃色熒光。對照組海馬各區(qū)均未見HIF-1α陽性表達；Cygb陽性信號出現(xiàn)在部分海馬錐形細胞胞漿及胞核，主要聚集于核膜和核仁周圍，海馬各區(qū)均有表達。低壓缺氧6h組海馬各區(qū)部分錐形細胞胞漿出現(xiàn)HIF-1 α陽性表達；Cygb表達增加，軸突及樹突中也出現(xiàn)陽性信號。低壓缺氧12h組海馬區(qū)大部分細胞皺縮變形，胞核固縮或破裂；胞漿及胞核區(qū)均可見HIF-1α陽性表達；Cygb表達進一步增加。18 h和24h組

8、HIF-1 α和Cygb均高表達；雖然大量錐形細胞壞死和凋亡，胞核碎裂或溶解，仍可見HIF-1α陽性信號主要集中于胞核區(qū)；Cygb在胞核區(qū)和胞漿中表達均顯著增加。 結論： 1. 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，低壓缺氧可造成大鼠腦組織海馬區(qū)錐形細胞損傷，包括細胞水腫、壞死、凋亡和Nissl體減少或消失；其損傷程度隨低壓缺氧時間的延長而加重。海馬各區(qū)損傷程度不同，CA1區(qū)對低壓缺氧最為敏感，損傷最嚴重；CA2、CA3、CA4區(qū)損傷依次減輕

9、。 2. 低壓缺氧后大鼠腦含水量增加，出現(xiàn)腦水腫，且腦水腫的嚴重程度隨低壓缺氧時間的延長而加劇。 3. 低壓缺氧造成大鼠腦組織細胞氧化應激損傷。SOD和CAT活性降低而MDA蓄積增加；NOS活性升高導致NO含量顯著增加。 4. 正常時HIF-1 α在海馬區(qū)神經細胞中無表達：低壓缺氧損傷后首先在胞漿出現(xiàn)陽性表達，隨著低壓缺氧損傷的持續(xù)表達逐漸增加并出現(xiàn)明顯的胞核聚集趨勢。提示HIF-1α產生于胞漿，但聚集于胞核內作

10、為轉錄因子結合DNA而起效。 5. 正常時Cygb在海馬區(qū)神經細胞的胞核、胞漿均有少量表達，主要集中于核膜和核仁周圍。隨著低壓缺氧損傷的持續(xù)，Cygb表達大量增加，其陽性信號遍布胞體和突起中。Cygb在神經細胞胞漿和胞核中均出現(xiàn)表達，并隨減壓缺氧時間的延長而表達增加，提示其不僅作為攜氧球蛋白在胞漿中發(fā)揮作用，可能也作為一種核轉錄因子起到基因調控作用。 6. 低壓缺氧后大鼠腦組織海馬區(qū)神經細胞中HIF-1 α和Cygb表達