人脂肪間充質干細胞靜脈移植治療大鼠顱腦損傷的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 重型創(chuàng)傷性腦損傷的治療是目前世界范圍內的一個難題。由于腦損傷后病理過程復雜，神經元損傷的不可逆性，神經系統本身的再生能力差等方面的影響，在治療方面面臨許多難題。目前傳統的治療方法不能從根本上逆轉神經元不可逆損傷這一病理機制，然而干細胞移植療法卻為這一醫(yī)學難題帶來了希望。近年來研究證實間充質干細胞對創(chuàng)傷性腦損傷具有一定的治療作用。其中人脂肪間充質干細胞hADSCs(Human Adipose-Derived Stem

2、 Cells)較其他間充質干細胞有取材方便、倫理限制少、易提取培養(yǎng)、可自體移植等優(yōu)點，且已有研究證明ADSCs在體外經適當誘導后能分化為神經元樣細胞，故hADSCs有望成為治療神經系統損傷新的種子細胞。
　　 分離培養(yǎng)hADSCs，并進行表面標志CD29、CD44、CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR的檢測。探索hADSCs經尾靜脈移植后，對急性創(chuàng)傷性腦損傷大鼠行為學以及損傷腦組織中GFAP、NSE和Nestine等

3、表達的影響。
　　 對象與方法:
　　 細胞的培養(yǎng)與鑒定：無菌條件下取成人遠隔病變部位的廢棄脂肪組織清洗、剪碎、消化、過濾制成單細胞懸液，最后將其移入含10％胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)及20g/L堿性成纖維生長因子(bFGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代。取培養(yǎng)至第四代的ADSCs細胞采用流式細胞儀分析法檢測細胞表面標志物：CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-AB

4、C、HLA-DR。
　　 動物模型的建立及分組：采用自由落體硬膜外撞擊法制作大鼠腦創(chuàng)傷模型。將大鼠分為移植組、對照組、和生理鹽水組。移植組于腦損傷48h時經尾靜脈注射Brdu標記的成人脂肪間充質干細胞；對照組不作處理；生理鹽水組于腦損傷48h時經尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。
　　 采用NSS評分法評價大鼠神經功能恢復情況；倒置顯微鏡hADSCs在損傷腦組織內的遷移情況；免疫組織化學法檢測大鼠受損腦組織中膠質纖維酸性蛋白

5、、神經元特異性烯醇化酶和巢蛋白的表達
　　 結果:
　　 原代培養(yǎng)的hADSCs24h后即可觀察到細胞貼壁。48h后貼壁細胞逐漸伸展開，周圍有脂滴沉淀。所培養(yǎng)的hADSCs，均勻地鋪于培養(yǎng)界面上，生長均勻，形狀規(guī)則呈長梭形，且生長增殖情況良好。約第7d時，hADSCs約80％融合，此時進行細胞傳代。傳代后th即可見細胞開始貼壁，貼壁細胞從圓形逐漸伸展為三角形、多角形、并逐漸變成梭形，均勻分布。經過較短的潛伏期后開始增殖。

6、傳代后的細胞增值速度明顯較原代細胞快。
　　 CD29和CD44高表達，而CD34、CD45、HLA-ABC、HLA-DR表達極低，符合間充質干細胞表面抗原的一般情況。
　　 移植組與對照組及假手術組比較，NSS評分7d時無差異，14d、21d、28d時移植組明顯低于其他兩組；在受損傷的腦組織周圍可發(fā)現經Brdu標記的hADSCs;移植組于移植后7d、14d、21d、28d時GFAP和NSE的陽性表達面積明顯低于對照組和

7、生理鹽水組，以細胞移植后14d差異最為明顯；移植組Nestin的陽性表達率在移植后7d開始增高，對照組和生理鹽水組未見明顯陽性表達；對照組和生理鹽水組在GFAP、NSE、Nestin的陽性表達方面無差異。
　　 結論:
　　 (1)經過分離、培養(yǎng)的hADSCs符合間充質干細胞表面抗原的一般情況。
　　 (2)經尾靜脈移植后，hADSCs可以進入受損大鼠的腦組織。
　　 (3)hADSCs對急性創(chuàng)傷性腦損傷