膠質(zhì)瘤中NANOG基因的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的：體內(nèi)外分別檢測(cè)NANOG基因在不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá),探討NANOG基因在膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為中的作用,并構(gòu)建NANOG慢病毒RNAi載體,為后續(xù)進(jìn)一步體內(nèi)外研究干擾NANOG基因表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響奠定基礎(chǔ)。
　　方法：(1)采用免疫組織化學(xué)染色法、Western blot和RT-PCR方法從蛋白和mRNA水平檢測(cè)50例不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織和7例正常腦組織標(biāo)本中NANOG的表達(dá)。(2)

2、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法從 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系分離培養(yǎng) BTSCs,采用單克隆形成實(shí)驗(yàn)純化BTSCs,觀察BTSCs在體外的增殖和分化,通過(guò)免疫細(xì)胞熒光染色法鑒定其干細(xì)胞特性;免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)U87腫瘤細(xì)胞及其BTSCs中NANOG的表達(dá)。(3)按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則結(jié)合慢病毒載體質(zhì)粒 pLKO.1-puro結(jié)構(gòu)的特征設(shè)計(jì)合成 shRNA序列,通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建NANOG基因 RNA干擾慢病

3、毒載體 pLKO.1-NANOG-shRNA,連同包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2 dvpr和包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G共同轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞,收集儲(chǔ)存可表達(dá)NANOG特異性shRNA慢病毒載體的病毒顆粒并進(jìn)行滴度測(cè)定。
　　結(jié)果：(1)NANOG蛋白在膠質(zhì)瘤組織WHOⅡ級(jí)、Ⅲ級(jí)和IV級(jí)中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.918,P=0.000),NANOG mRNA的相對(duì)含量在膠質(zhì)瘤組織WHOⅡ級(jí)、Ⅲ級(jí)、IV級(jí)中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

4、F=65.901,P=0.000),NANOG蛋白和mRNA表達(dá)水平隨著病理級(jí)別增高而升高,而在正常腦組織中均未見(jiàn)表達(dá)。(2)利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法從U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中成功分離培養(yǎng)出BTSCs,具有自我更新與增殖能力,表達(dá)特異性干細(xì)胞標(biāo)記物CD133,在SCM中BTSCs發(fā)生貼壁分化,表達(dá)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物NSE和GFAP。NANOG蛋白水平在U87腫瘤細(xì)胞和BTSCs中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.719,P=0.000

5、),NANOG mRNA相對(duì)含量在U87腫瘤細(xì)胞和BTSCs中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.770,P=0.000),BTSCs的NANOG蛋白和mRNA表達(dá)水平高于U87腫瘤細(xì)胞。(3)構(gòu)建的NANOG基因RNA干擾慢病毒載體pLKO.1-NANOG-shRNA經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符,慢病毒重組體構(gòu)建成功,將pLKO.1-NANOG-shRNA、pCMV-dR8.2 dvpr和pCMV-VSV-G三質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293

6、T包裝細(xì)胞后,收獲病毒并測(cè)定病毒滴度為106TU/ml。
　　結(jié)論：(1)NANOG在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),表達(dá)水平隨著病理級(jí)別增高而升高,而在正常腦組織中均未見(jiàn)表達(dá)。(2)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的BTSCs;NANOG在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中高表達(dá),在BTSCs中表達(dá)水平高于U87腫瘤細(xì)胞。(3)成功構(gòu)建了慢病毒RNAi載體pLKO.1-NANOG-shRNA,測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功,并完成了病毒的包裝、儲(chǔ)存和