囊泡轉運及重大疾病相關膜蛋白的純化方法與蛋白性質研究.pdf

1、囊泡轉運和融合過程作為細胞生長繁殖的基本特征之一，在蛋白上膜及分泌途徑中發(fā)揮重要的功能。囊泡的轉運和分泌在各個階段都需要一系列具有特殊功能的蛋白質的參與。Munc13-1在細胞中囊泡的啟動分泌階段發(fā)揮著重要作用。Exocyst復合物在囊泡的拴系和錨定過程中同樣不可或缺。目前，對此類蛋白的性質和特征以及蛋白的三維晶體結構的研究有利于我們深入了解它們在囊泡轉運過程中的分子作用機制。本文采用原核表達體系和層析技術表達純化了一系列具有結構功能特

2、征的Munc13-1 缺失突變體，結合圓二色光譜，動態(tài)光散射和分析超速離心等體外蛋白研究技術對各缺失突變體蛋白的性質進行了系統(tǒng)的分析和比較。Munc13-1 各缺失體蛋白的聚合狀態(tài)，顆粒均一性及蛋白穩(wěn)定性都存在著顯著的差異。根據圓二色光譜和分析超速離心實驗結果，我們首次發(fā)現了Munc13-1蛋白在溶液中的長棒狀伸展螺旋束構象結構。結合同源建模構建了Munc13-1蛋白在體內以單體方式發(fā)揮功能的模型。Exocyst復合物的亞基蛋白Sec1

3、0的體外表達純化研究發(fā)現，Sec10蛋白本身作為一個相對折疊緊密的結構來發(fā)揮功能，蛋白N 端或者C 端氨基酸的部分缺失都不可避免的導致了Sec10在表達過程中的錯誤折疊，形成包涵體。電鏡分析發(fā)現了聚合的Sec10蛋白大部分以球形結構存在。
　　 GABAB 受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體中的C蛋白家族，與各類神經和精神錯亂疾病有關。我們通過低溫表達和包涵體變性復性實驗得到了可用于結晶的具有藥物結合靶點活性的胞外蛋白片斷。葡萄糖轉運蛋白G

4、LUT4 (Glucose Transporter 4)作為II型糖尿病領域研究中的關鍵蛋白，在維持體內糖平衡起到重要作用。目前世界上還未有關于體外組織大規(guī)模純化GLUT4的相關報道。我們首次嘗試選用豬脂肪作為原材料，采用組織勻漿，差速離心和硫酸銨沉淀方法初步分離純化并獲得了足夠蛋白產量和純度的GLUT4。
　　 膜蛋白的純化與結晶是當前結構生物學領域里的一大難題。當前蛋白表達提取，蛋白性質優(yōu)化等研究為進一步的結晶學研究打下基礎