SSH分離鑒定大鼠腎臟發(fā)育基因，Pea3基因在大鼠腎臟發(fā)育中的表達及意義.pdf

1、為了更好地探討腎臟后期發(fā)育的分子機制，本研究利用生后發(fā)育這個時間窗口，從腎臟后期發(fā)育角度出發(fā)來篩選腎臟發(fā)育相關基因。 第一部分大鼠腎臟發(fā)育相關基因差減文庫的構建及驗證 目的：分離大鼠腎臟發(fā)育相關基因，構建雙向差減文庫并驗證。 方法：分別以新生大鼠腎臟組織為檢測組(tester)、生后21天腎臟為驅逐組(driver)，進行正向SSH；以生后21天腎臟為tester、新生大鼠腎臟組織為driver，進行反向SSH。

2、經(jīng)過總RNA的提取、mRNA的純化、反轉錄、酶切、接頭連接、2輪差減雜交和2輪PCR，獲得正、反向差減雜交產(chǎn)物，將其克隆入質粒表達載體pGEM~-TEasy載體，轉入XL2-BlueMRF'UitracompetentCells以擴增，克隆，測序，生物信息學分析，并隨機挑選部分基因用RT-PCR技術驗證其差異表達。 結論：RT-PCR所驗證基因的表達趨勢與差減文庫表達譜趨勢一致，提示所構建文庫的可靠性和可信度。該差減文庫為進一步

3、研究腎臟發(fā)育提供了一個良好的平臺。 第二部分Pea3基因在大鼠腎臟不同發(fā)育時期的表達及意義 目的：驗證Pea3(Polyomavirusenhanceractivator3)基因的差異表達，并分析該基因在整個腎臟發(fā)育不同時期的時空表達規(guī)律。 方法：應用RT-PCR、WesternBlot、原位雜交技術檢測不同發(fā)育時期大鼠腎臟組織Pea3基因mRNA和蛋白水平的表達情況。 結論：隨著大鼠腎臟組織的不斷成熟，

4、Pea3基因表達逐漸下調，提示該基因可能參與腎臟的發(fā)生發(fā)育，其主要表達在輸尿管芽分枝端和濃縮的后腎間充質上，提示該基因可能參與腎臟發(fā)育中上皮-基質之間的相互誘導發(fā)育過程。 本課題的特征和創(chuàng)新之處在于：(1)本文采用SSH技術首次對新生大鼠和生后21天大鼠腎臟發(fā)育相關基因表達譜特征進行了初步研究，并對差異表達基因進行生物信息學分析，獲得了多個有意義的差異表達基因。(2)首次觀察Pea3基因從胚胎到成年大鼠腎臟組織中的時空表達情況，