Hsp90β亞型對于GR信號通路的伴侶作用的研究.pdf

1、真核生物細胞中熱休克蛋白90(Hsp90s)作為關鍵的和廣泛存在的分子伴侶，對于一系列客戶蛋白的折疊、活化和組裝具有重要的作用，從而影響信號轉導、細胞周期調控和轉錄調節(jié)等過程。糖皮質激素受體(GR)是非常重要的信號分子，與糖皮質激素(GC)結合后引起廣泛的生理效應和藥理效應，對于許多生理過程如應激、代謝、炎癥和免疫反應具有不可缺少的調節(jié)作用。 GR是Hsp90的客戶蛋白之一，研究得較為深入，Hsp90對GR的作用過程可以代表性的

2、展示分子伴侶蛋白對信號分子的處理和作用方式。我們知道，Hsp90能夠改變GR的立體構象，使GR的配體結合域象一個口袋一樣打開，從而能夠與糖皮質激素結合。當GC濃度增加，Hsp90從多種蛋白組成的GR復合體解離，使GC有機會進入這。一口袋，得以與配體結合域結合。然后將會形成一個新的多蛋白復合體，包括GR,Hsp70,Hsp56和親免素。Hsp70和Hsp56將發(fā)揮對已活化的GR復合體的導向功能，使GR轉運到細胞核內，然后GR可以上調或者下

3、調目標基因的轉錄從而得以發(fā)揮生理效應。然而，有研究者指出，GR與GC結合后，仍然是在Hsp90的參與下并依賴于細胞骨架結構才從胞漿向胞核運動。 胞漿中的Hsp90主要有兩種亞型，Hsp90ct(誘導型)和Hsp90p(組成型)。這兩種亞型的編碼基因位于不同的染色體。比對發(fā)現，同物種(如人或小鼠)的兩種亞型的堿基序列的同源性低于不同物種之間的(如人與小鼠之間)相同亞型的序列同源性。而且，Hsp90a和Hsp90p的表達與誘導模式都

4、不一致?？紤]到這些，我們設想Hsp90a和Hsp90p在發(fā)揮對GR信號通路的伴侶功能方面具有不同的作用。我們進一步假設，Hsp90p亞型，而非Hsp90a亞型，才是使GR形成能結合GC的成熟構象的關鍵分子。 眾所周知，不同的個體可能因為遺傳背景不一致而具有不同的糖皮質激素敏感性。最近的研究指出，正常人群中6．6％的人對糖皮質激素相對高敏，而2．3％的人對糖皮質激素相對抵抗。盡管少數家系對GC抵抗的病例具有GR基因的多態(tài)性，許多病

5、例并沒有發(fā)現這種GR基因多態(tài)性。既然Hsp90在GR信號通路中扮演的角色極為關鍵，我們設想一些個體糖皮質激素的敏感性不同源于Hsp90p基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。我們實驗室發(fā)現，遺傳背景相似的兩種小鼠，C57BL／6和BALB／c，在全身性沖擊傷和急性胰腺炎損害中，耐受潛能和死亡率不一致。我們發(fā)現這兩種品系小鼠的GR效應是不一致的，GR核轉位能力不一樣，與染色質的結合能力也不一樣，我們認為GR效應的差異至少是損傷耐受能力表型差異的

6、部分原因。所在實驗室已完成了對C57BL／6小鼠的Hsp84mRNA全長測序工作，當和Genebank上面已提交的BALB／c小鼠的Hsp84mRNA序列比對時發(fā)現有四個堿基發(fā)生錯義突變，使Hsp84蛋白質的4個氨基酸殘基發(fā)生替換。我們將進一步檢查這一個假設：這兩種品系小鼠Hsp84存在著SNP，決定了GR效應的差異，進而影響炎癥和損傷耐受方面的表型差異。 一研究目標 1．證明Hsp90a、Hsp90p(小鼠Hsp84、

7、Hsp86)對于GR形成并維持能結合GC的成熟構象進而與GC結合后從胞漿轉運到胞核等環(huán)節(jié)的作用有差異。 2．證明Hsp84基因多態(tài)性能夠影響GR的生物學效應，即來源于C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠的Hsp84在協(xié)助GR從細胞漿到細胞核轉位的方面具有不同的效率,Hsp84基因多態(tài)性是遺傳背景高度同源的C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠炎癥反應程度差別顯著的重要原因。 二研究內容和研究結果 1．將化學合成的三

8、段寡聚核苷酸與線性化的pSUPER-EGFP載體連接獲得了可用于沉默Hsp90p基因實驗的三個質粒，測序驗證沉默質粒構建成功。我們先后用不同的脂質體和質粒比例轉染HUVEC、HepG2、HEK293三種細胞，以綠色熒光蛋白作為評價轉染效率的指標，在HEK-293細胞中優(yōu)化轉染條件，轉染效率可以達到80％左右。2通過RT-PCR的方法擴增小鼠Hsp84基因，將其先后重組入pMDl8-T和pcDNA3．1載體，通過測序和雙酶切的方法表明載體

9、構建正確，得到了可用于在真核細胞中表達Hsp84蛋白的重組質粒pcDNA3．1一hsp84。 3用半定量PCR的方法，通過與空質粒轉染組和未處理組比較發(fā)現：pSuper-Hsp9082轉染后18小時HEK-293細胞中Hsp90BmRNA水平明顯下降，而pcDNA3．1一hsp84轉染后18小時HEK-293細胞中Hsp90BmRNA水平明顯上升。 4GR結合GC后會從細胞漿向細胞核轉移以調節(jié)基因轉錄，細胞核中GR與細胞

10、漿中GR數量的比值會增大。免疫印跡實驗發(fā)現，pcDNA3．1-Hsp84轉染HEK-293細胞24h后，與正常細胞組和pcDNA3．1組相比，GR核漿IOD相對值的比顯著升高。pSuper-Hsp9082轉染細胞24h后，與正常細胞組和pSuper—control組相比，GR核漿IOD相對值的比顯著下降。這提示Hsp90B是負責使GR構象轉化的亞型。 5BALB／c小鼠來源的Hsp84mRNA通過RT-PCR，將全長編碼框插入p