新型陽離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70載TGF-β1反義寡核苷酸轉染心肌細胞的研究.pdf

1、目的：心血管重構是高血壓、冠心病、心力衰竭的重要病理生理改變，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）及其受體在心肌細胞內的過度表達促進重構的發(fā)生、發(fā)展。
　　 目前反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide， AS-ODN)的基因治療已經擁有良好應用前景，但是在心血管疾病臨床治療方面尚在積極研究中，本研究旨在用陽離子磷酸膽堿聚合物MPC30-DEA70

2、作為運載系統(tǒng)，探討MPC30-DEA70能否有效地負載針對大鼠TGF-β1基因的AS-ODN(TGF-β1AS-ODN)進入心肌細胞，及對該基因胞內生物表達的影響。
　　 方法：
　　 1．應用原子轉移自由基聚合(atom transfer radicalpolymerization, ATRP)法合成具有高度生物相容性的MPC30-DEA70，并對材料的溶液性質進行表征，按不同N/P電荷比值將MPC30-DEA70與T

3、GF-β1AS-ODN絡合成形成基因復合物并且對其總電性進行表征。
　　 2．差速貼壁法分離和培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞并利用肌鈣蛋白Ⅰ抗體行免疫熒光(Immunofluorescence technique, IFT)鑒定。
　　 3．采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)檢測MPC30-DEA70與原代培養(yǎng)的心肌細胞的生物相容性；應用熒光顯微鏡(FM)、共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)、透射電子顯微鏡(TEM)觀察M

4、PC30-DEA70（FITC標記）及MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN（FAM標記）在細胞內的分布和定位，流式細胞儀(FCM)、FM檢測二者的細胞轉染效率、熒光強度。
　　 4．免疫印跡實驗(Western blot)、RT-PCR檢測TGF-β1細胞內表達。
　　 結果：
　　 1．原代培養(yǎng)的細胞光鏡下呈梭形、不規(guī)則三角形或多角形，核呈卵圓形并居中，搏動規(guī)則而且同步，鑒定示純度超過85％。

5、>　　 2. MPC30-DEA70與心肌細胞具有較好的細胞相容性，在較高濃度（＞20μl/ml）下才表現(xiàn)出一定的細胞毒性并呈劑量依賴。
　　 3. MPC30-DEA70及MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN進入細胞后大部分分布于核周，少部分可以進入胞核，對心肌細胞的超微機構無明顯影響；對心肌細胞均具有較好的轉染效率，呈劑量依賴性。
　　 4. MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN在較高N/P