暗紋東方鲀TLRs和SOD基因的分子特征與免疫應答的初步研究.pdf

1、暗紋東方鲀是一種典型的溯河洄游性魚類，具有極高的經(jīng)濟價值，目前對暗紋東方鲀的研究主要集中在生長發(fā)育、鹽度適應、洄游習性等方面，對其免疫相關基因和抗病因子應對病菌感染的免疫應答機制研究少有報道。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為一類最重要的模式識別受體(germline-encoded pattern recognition receptors，PRRs)，其主要通過識別和結(jié)合保守的病原體相關分子模式(

2、pathogen-associated molecular Patterns，PAMPs)以激活先天免疫應答，在抵御外界病原入侵的過程中扮演重要角色。而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)作為一種較為重要的抗氧化物金屬酶，在生物體中起到了保護機體免受超氧陰離子損傷的作用。本文以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，研究了暗紋東方鲀TLRs和SOD基因在嗜水氣單胞菌或LPS刺激下的表達變化規(guī)律，為進一步探究暗紋東方鲀先天性免

3、疫應答的分子機制提供了理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)暗紋東方鲀TLRs基因的分子特征與免疫應答初步分析
　　通過同源比對以及RACE技術成功克隆出暗紋東方鲀TLR2、TLR7和TLR21的基因cDNA全長序列分別為3666bp、3359bp和3259bp;預測其包括開放閱讀框(ORF)分別為2616bp、3144bp和2898bp，分別編碼871、1047和965個氨基酸;其5'UTR分別為85bp、47bp和10

4、4bp，3'UTR區(qū)分別為965bp、168bp、257bp。TLR2和TLR7基因的3'UTR區(qū)均具有典型的加尾信號AATAAA和1個mRNA不穩(wěn)定信號ATTTA，TLR21基因僅具有1個mRNA不穩(wěn)定信號ATTTA。氨基酸序列分析表明TfTLR2、TfTLR7和TfTLR21均包含TLRs家族4個典型的結(jié)構，分別是信號肽、胞外LRR結(jié)構域、跨膜區(qū)和細胞質(zhì)TIR結(jié)構域。同源性比對顯示暗紋東方鲀TLR2、TLR7和TLR21氨基酸序列與

5、其它物種的同源性分別在25-98％、54-99％和40-99％之間，其中與同為東方鲀屬的紅鰭東方鲀同源性最高。系統(tǒng)進化樹分析表明這3個TLRs基因在魚類中高度保守。
　　通過熒光定量PCR技術檢測TLR2、TLR7和TLR21基因在暗紋東方鲀不同組織中的表達分布，結(jié)果顯示，這3個TLRs基因在肝、腎、肌肉、腦、脾、鰓、腸、心臟8個組織中均有表達，其中在免疫相關組織肝、腎和脾中表達量均較高。對嗜水氣單胞菌或LPS注射處理下的暗紋東方

6、鲀肝、腎和脾3種組織進行分析，發(fā)現(xiàn)TfTLR2、TfTLR7和TfTLR21基因的mRNA表達量在病菌注射組中均顯著差異表達(P＜0.05)。通過Western Blot技術，分析了肝組織TfTLR2和脾組織TfTLR7蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)這2個TfTLRs蛋白的表達量在病菌感染下均顯著上調(diào)(P＜0.05）。此外，實驗結(jié)果顯示，相較于LPS感染，嗜水氣單胞菌感染能夠更快使暗紋東方鲀產(chǎn)生免疫應答反應。
　　(2)暗紋東方鲀SOD基因的

7、表達分析
　　通過熒光定量PCR技術檢測MnSOD和Cu/ZnSOD基因在暗紋東方鲀不同組織中的表達分布，結(jié)果顯示，這2個SOD基因在暗紋東方鲀肝、腎、肌肉、腦、脾、鰓、腸、心臟8個組織中均有表達，其中在肝組織表達量均最高，其次是心臟和腦，在其它組織中的表達量均非常低。對嗜水氣單胞菌或LPS注射處理下的暗紋東方鲀肝、腎和鰓3種組織進行分析，發(fā)現(xiàn)這2個SOD基因的mRNA、酶活以及蛋白在病菌感染下均發(fā)生了顯著差異表達(P＜0.05）