雌激素對大鼠咀嚼肌功能狀態(tài)影響的體外研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)是口腔常見病，病因復雜，涉及到咀嚼肌、顳下頜關(guān)節(jié)以及各相關(guān)結(jié)構(gòu)。TMD的發(fā)病率女性高于男性，其嚴重程度與年齡有關(guān)。TMD多開始于青春期，在生育年齡達到高峰。女性高發(fā)病率以及年齡分布特點提示雌激素可能與TMD的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。 雌激素的生物學效應是通過受體(estrogen receptors，ER)介導的。研究表明顳下頜關(guān)節(jié)髁突、軟骨、關(guān)節(jié)盤、

2、關(guān)節(jié)囊中存在ER，因此雌激素可能對顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育、改建重建及代謝產(chǎn)生影響。但是雌激素對于咀嚼肌功能狀態(tài)的作用還不十分清楚。咀嚼肌的功能與顳下頜關(guān)節(jié)的功能活動及TMD的發(fā)病息息相關(guān)。咀嚼肌功能紊亂得不到及時治療，肌的紊亂可導致關(guān)節(jié)內(nèi)壓增加和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)間的摩擦，損傷關(guān)節(jié)組織，可能發(fā)展為結(jié)構(gòu)紊亂疾病及骨關(guān)節(jié)病，導致或加重關(guān)節(jié)損害。而如果及時阻斷病因循環(huán)中的肌功能紊亂環(huán)節(jié)，有可能減輕或阻止其它類型顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)展。 本研究

3、的目的就在于通過建立咀嚼肌成肌細胞的體外培養(yǎng)模型，研究成肌細胞中ER的表達以及不同濃度17β-雌二醇對咀嚼肌成肌細胞增殖、肌球蛋白重鏈mRNA轉(zhuǎn)錄和細胞內(nèi)鈣離子的影響，試圖揭示雌激素對咀嚼肌特性和功能狀態(tài)的影響，從而探討雌激素在TMD咀嚼肌紊亂病中的作用。 為建立大鼠咀嚼肌成肌細胞體外培養(yǎng)模型，以機械分離加酶消化法從5-7天SD大鼠頜面部獲取成肌細胞，以差速貼壁法純化細胞，觀察細胞形態(tài)，建立生長曲線，以免疫細胞化學染色方法鑒定獲

4、得的細胞。結(jié)果表明培養(yǎng)的成肌細胞結(jié)蛋白(Desmin)染色陽性，陽性染色細胞數(shù)大于95％，表明獲得的成肌細胞純度較高。所以本實驗所建立的大鼠咀嚼肌成肌細胞體外培養(yǎng)模型可以用于后續(xù)的實驗。 為觀察成肌細胞中ER的表達，在細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的17-β雌二醇，以免疫細胞化學染色方法檢測ER的表達。結(jié)果表明，ERα和ERβ在成肌細胞中都有表達，ERα的表達強于ERβ，ERα主要表達于細胞核，而ERβ主要表達于細胞漿。雌激素能上調(diào)E

5、Rα和ERβ的表達，在10<'10>～10<'-8>Smol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。因此，咀嚼肌成肌細胞能夠表達功能性雌激素受體，受體的表達受雌激素的調(diào)節(jié)；咀嚼肌可能是雌激素的靶組織。 為研究雌激素對咀嚼肌成肌細胞增殖的作用，在細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的17-β雌二醇，以<'3>H-TdR法檢測細胞增殖情況。結(jié)果顯示，除了在10<'-8>mol/L時有一波動外，17-β雌二醇隨著濃度的增加都能降低成肌細胞<'3>H-TdR的

6、摻入率，呈劑量依賴性，在10<'-6>mol/L時作用最明顯。成肌細胞的增殖對于咀嚼肌的生長發(fā)育、修復重建有重要作用。因此，雌激素可能抑制咀嚼肌成肌細胞的增殖，從而影響咀嚼肌的功能。 為研究雌激素對咀嚼肌成肌細胞肌球蛋白重鏈亞型mRNA表達的影響，在細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的17-β雌二醇，以熒光定量RT-PCR的方法檢測mRNA的表達。結(jié)果顯示雌激素能明顯上調(diào)MHC Ⅰ mRNA的表達，對MHC Ⅱb mRNA的表達有明顯下調(diào)

7、作用。雌激素對MHC Ⅱ a和Ⅱ x的作用不明顯。MHC亞型表達的不同決定著肌肉不同的收縮特性。因此雌激素能調(diào)節(jié)咀嚼肌成肌細胞MHC亞型mRNA的表達，從而可能影響咀嚼肌的功能特性。 為研究雌激素對咀嚼肌成肌細胞胞漿鈣離子的影響，以酸刺激模擬咀嚼肌疲勞狀態(tài)，以Fluo-4-AM對細胞內(nèi)鈣離子染色，通過激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察一段時間內(nèi)靜息狀態(tài)下以及酸性刺激下雌激素對咀嚼肌細胞胞漿Ca<'2+>濃度的影響。結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)下，加

8、入10<'-9>mol/L、10<'-8>mol/L和10<'-7>mol/L的17 β-雌二醇后使細胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，隨即迅速下降并在與靜息狀態(tài)胞漿鈣離子濃度相當?shù)乃缴现匦滦纬蓜討B(tài)平衡；酸刺激時，加入10<'-9>mol/L、10<'-8>mol/L和10<'-7>mol/L的17 β-雌二醇后使細胞內(nèi)鈣離子濃度迅速降低，并在比原來低的水平上形成新的動態(tài)平衡。胞漿鈣離子對維持細胞正常功能有重要作用，鈣離子蓄積是骨骼肌疲勞及損傷

9、的關(guān)鍵事件。因此，一定濃度的雌激素能夠使酸刺激下的咀嚼肌成肌細胞鈣離子濃度維持在較低的水平，從而減少胞漿鈣離子超載，維持咀嚼肌正常的功能。 總之，本研究成功培養(yǎng)了大鼠咀嚼肌成肌細胞，可以作為體外培養(yǎng)模型進行相關(guān)研究。咀嚼肌成肌細胞中有雌激素受體的表達，咀嚼肌是雌激素的靶組織。雌激素能夠抑制成肌細胞的增殖，調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈亞型mRNA的表達，改變咀嚼肌的特性，并能減少酸刺激下成肌細胞胞漿鈣離子的蓄積。從結(jié)果看，雌激素對咀嚼肌的作用