乙型肝炎病毒聚合酶新功能區(qū)的發(fā)現(xiàn)和意義研究.pdf

1、乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus，HBV) 感染在全球超過(guò)3億人。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，該科具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過(guò)特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行復(fù)制。HBV編碼的聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶 (Reverse transcriptase，RT)的結(jié)構(gòu)和功能在其復(fù)制過(guò)程中起重要作用。但是，至今具有酶活性的HBV RT仍不能足量表達(dá)用于體外生化研究和晶體學(xué)分析。此外，也沒(méi)有合適的體外感染系統(tǒng)用于分析復(fù)雜的HBV復(fù)制周期

2、。通過(guò)對(duì)分離自乙肝病人的兩株B基因型HBV的全基因組克隆和基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的復(fù)制效率測(cè)定，我們?cè)鴪?bào)道HBV RT第306位脯氨酸(rtP306)置換為絲氨酸或其他氨基酸時(shí)，大部分變異體的復(fù)制效率下降。為闡明這些變異體復(fù)制效率下降的機(jī)理，我們首先構(gòu)建－C基因型毒株的rtP306變異體并轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，然后比較變異體與原毒株的復(fù)制能力、轉(zhuǎn)錄水平和pgRNA包裝效率。通過(guò)基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的復(fù)制效率測(cè)定發(fā)現(xiàn)rtP306變異體復(fù)制效率下降，而且RT變

3、異體與RT缺失復(fù)制子rtW58<'*>的反式補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一現(xiàn)象。 為深入了解復(fù)制效率下降的機(jī)理，首先分析變異體和原毒株的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示各rtP306變異體具有相似的轉(zhuǎn)錄水平。而且Western印跡顯示rtP306氨基酸置換并不影響RT穩(wěn)定性。我們通過(guò)特異性的pgRNA包裝實(shí)驗(yàn)和內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)分析HBV RT的兩大主要功能：參與pgRNA包裝和催化核苷轉(zhuǎn)移合成子代病毒DNA。pgRNA包裝效率用細(xì)胞內(nèi)衣殼顆粒量校正后的衣

4、殼顆粒內(nèi)pgRNA量表示，細(xì)胞內(nèi)衣殼顆粒用抗衣殼蛋白抗體進(jìn)行Western印跡測(cè)定。包裝實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大部分rtP306變異體的pgRNA包裝效率下降。這一結(jié)果也被內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)所確認(rèn)。同時(shí)，通過(guò)內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)一些rtP306氨基酸置換導(dǎo)致RT核苷轉(zhuǎn)移酶活性下降。 基于上述發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)除了rtP306外，rtP306附近的氨基酸(rt304-311)對(duì)HBV復(fù)制同樣重要。通過(guò)將rt304-311位氨基酸置換為丙氨酸或苯丙

5、氨酸構(gòu)建變異體并測(cè)定其復(fù)制效率，我們發(fā)現(xiàn)rt304-311置換確實(shí)導(dǎo)致HBV復(fù)制效率明顯下降。相關(guān)機(jī)理不是轉(zhuǎn)錄水平或RT穩(wěn)定性改變而是pgRNA包裝效率下降。作為對(duì)照，遠(yuǎn)離rtP306的氨基酸(rt336和rt346)置換不影響病毒復(fù)制效率。據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道rt304-311氨基酸保守在pgRNA包裝中起重要作用。此外，與原毒株相比，rtY305A變異體對(duì)抗病毒藥阿德福韋的敏感性下降。阿德福韋據(jù)報(bào)道作用于HBV RT“手掌”域的

6、酶活性中心，而rtY305置換位于HBV RT“拇指”域，因此藥敏實(shí)驗(yàn)提示rt304-311氨基酸置換可能改變HBV RT構(gòu)型從而導(dǎo)致與抗病毒藥的親和力下降。 此外，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析rt304-311對(duì)HBV RT和HBV復(fù)制的作用，結(jié)果顯示：1) 預(yù)測(cè)rt304-311位于HBV RT“拇指”域一螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角上，這一螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)稱(chēng)為螺旋鉗基序；2)轉(zhuǎn)角氨基酸在已報(bào)導(dǎo)的基因型A-H毒株中非常保守；3)

7、部分HBV RT轉(zhuǎn)角氨基酸在逆轉(zhuǎn)錄病毒RT和丙型肝炎病毒RNA依賴(lài)的RNA聚合酶的螺旋鉗基序中保守。螺旋鉗基序是真核生物、細(xì)菌和病毒的核酸聚合酶拇指域中一共同的結(jié)構(gòu)元件，在聚合反應(yīng)時(shí)可結(jié)合核酸模板和引物。因此，我們通過(guò)生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)方法確認(rèn)了HBV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角(rt304-311)，該轉(zhuǎn)角作為一新功能區(qū)可能通過(guò)控制HBV RT與核酸的親和力來(lái)調(diào)節(jié)HBV pgRNA包裝效率。 人免疫缺陷病毒 (Human immu

8、nodeficiency virus，HIV) 是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬的研究模型。與HBV相似，HIV也通過(guò)特有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行復(fù)制。為研究HIV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角是否在HIV復(fù)制中起重要作用，以一HIV前病毒質(zhì)?；A(chǔ)上將HIV RT轉(zhuǎn)角置換為丙氨酸。通過(guò)單周期感染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各變異體的復(fù)制能力。初步結(jié)果顯示HIV-1轉(zhuǎn)角變異體(rtY271A和rt1274A)不能在 Jurkat 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。而且，HIV-1 RT轉(zhuǎn)角變異體(rtY27

9、1A和rt1274A)與DNA模板/引物結(jié)合能力下降?？傊?，HBV RT和HIV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角在病毒復(fù)制過(guò)程中起重要作用并且可以作為抗病毒藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)。 目前，已注冊(cè)的抗HBV藥物如拉米呋啶，阿德福韋酯和恩替卡韋都是作用在HBV RT催化中心的核苷(酸)類(lèi)似物。長(zhǎng)期使用這些藥物將導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)。因此迫切需要發(fā)展新的抗HBV藥物。在篩選針對(duì)HBV RT和HIV RT螺旋鉗基序轉(zhuǎn)角的化合物時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)一種非核苷類(lèi)似物KM

10、-1,2-萘磺酸，4-羥基-7-[[[[5-羥基—6-[(4-肉桂酸苯基)偶氮]-7-磺酸-2-萘基]氨基]羰基]氨基]-3-[(4-肉桂酸苯基)]偶氮(2-naphthalenesulfonic acid，(4-hydroxy-7-[[[[5-hydroxy-6-[(4-cinnamylphenyl)azo]-7-sulfo-2-naphthaIenyl]amino]carbonyl]amino]-3-[(4-cinnamylphen

11、yl)]azo))曾被報(bào)道通過(guò)與已知非核苷類(lèi)似物不同的機(jī)制有效地抑制HIV RT。而且，據(jù)推測(cè)，KM-1針對(duì)HIV RT的“拇指”域。因此，我們采用多種方法評(píng)價(jià)KM-1的抗HBV活性。通過(guò)內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)發(fā)現(xiàn)KM-1抑制野生型HBV RT及其對(duì)三磷酸拉米呋啶耐藥的變異體rtL180M/M2041，50％抑制濃度分別為2.6μM和0.5μM，因此KM-1通過(guò)與三磷酸拉米呋啶不同的機(jī)制抑制HBV RT。通過(guò)基于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的復(fù)制效率測(cè)定發(fā)現(xiàn)KM