高通量測序篩選肝癌細(xì)胞中受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA.pdf

1、目的：
　　Dicer是核糖核酸酶Ⅲ家族成員之一，在RNAi(RNA interference，RNAi)途徑中起著關(guān)鍵作用，是microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)生物合成過程中的關(guān)鍵酶。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是細(xì)胞中廣泛存在的、對基因表達(dá)起調(diào)控作用、但自身不翻譯產(chǎn)生蛋白的RNA分子。ncRNA包括siRNA，miRNA和長非編碼RNA(long

2、 non-coding RNA，lncRNA)等等。
　　近年來研究表明，ncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，在肝臟中敲除Dicer導(dǎo)致肝癌發(fā)生。因此我們推測受Dicer調(diào)節(jié)的ncRNA可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本論文試圖研究在肝癌細(xì)胞系中Dicer能夠調(diào)節(jié)哪些ncRNA的表達(dá)，并用生物信息學(xué)方法對這些受Dicer調(diào)節(jié)的ncRNA進(jìn)行初步功能注釋，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　用RNA干擾技

3、術(shù)在HepG2.2.15細(xì)胞中抑制Dicer的表達(dá)，然后用Illumina測序?qū)icer knockdown細(xì)胞和對照細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和小RNA測序，并運用生物信息學(xué)方法對測序結(jié)果進(jìn)行分析。在對原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制過濾后，將兩種測序數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基因組比對、基因差異表達(dá)、miRNA表達(dá)以及靶基因預(yù)測等分析，再綜合兩類測序的數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，從已知的miRNA及其預(yù)測靶基因的表達(dá)、來源于Rfam的lncRNA表達(dá)等方面研究并分析受Dice

4、r調(diào)節(jié)的相關(guān)ncRNA的表達(dá)情況，并進(jìn)行初步功能分析。
　　結(jié)果：
　　整合兩種高通量測序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)168個成熟體miRNA在樣本間存在顯著性表達(dá)差異，并對這些miRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測。同時，在轉(zhuǎn)錄組水平獲得表達(dá)差異顯著的4，019個mRNA記錄，功能注釋結(jié)果顯示差異表達(dá)基因在細(xì)胞表面受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、G蛋白耦合受體信號通路等多個方面呈現(xiàn)高度富集。將通過小RNA測序得到的差異miRNA的預(yù)測靶基因與這4，01

5、9個mRNA記錄進(jìn)行交叉重疊比較，得到2，284個記錄(＞56％)，即它們不僅是樣本之間表達(dá)有顯著差異的miRNA的靶基因，且在RNA水平表達(dá)差異顯著。對來源于Rfam-lncRNA的小RNA(sRNA)表達(dá)分析結(jié)果顯示，來源于7SL RNA的小RNA在樣本間的表達(dá)差異顯著。而在重復(fù)序列分析中，重復(fù)序列的表達(dá)總量在兩個測序數(shù)據(jù)中均不存在明顯的樣本間差異。對NATs表達(dá)分析的結(jié)果表明，來源于NATs的小RNA總量在抑制Dicer的樣品中降

6、低，但在轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)并未顯示出相應(yīng)上升的趨勢。
　　結(jié)論：
　　在對Dicer表達(dá)受抑制的樣本和對照組樣本中的RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析和比較后，我們首先發(fā)現(xiàn)多個參考基因和miRNA在樣本間存在差異表達(dá)，其中超過一半的差異表達(dá)基因是這些miRNA的預(yù)測靶基因，因此這些基因在樣本間的表達(dá)變化可能是由miRNA的改變引起的，進(jìn)一步的功能注釋結(jié)果顯示受Dicer調(diào)節(jié)的基因參與多個生物途徑。此外，Rfam-lncRNA數(shù)據(jù)庫中，7