新分子ITIP表達、特性鑒定與抗腫瘤免疫效果及機制研究.pdf

1、腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的疾病,近年的研究表明:通過合理的綜合治療,可以提高惡性腫瘤的治療效果。腫瘤生物治療作為繼傳統(tǒng)的手術、放療和化療之后的第四種治療模式在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮愈來愈重要的作用。在腫瘤患者重建有效的免疫應答及抑制腫瘤的血管形成,是腫瘤治療的兩個重要策略。趨化因子不僅可引導淋巴細胞定向遷移,同時又能抑制血管形成,阻斷腫瘤的血液供應,因此是腫瘤生物治療的理想選擇。
　　已有的研究表明,CXC亞家族趨化因子IFN誘導

2、的T細胞α趨化因子(ITAC)和IFN-γ誘導蛋白10(IP10)既具有募集表達CXC趨化因子受體3(CXCR3)淋巴細胞的功能,誘導Th1型免疫應答,又能夠抑制血管生成。功能分析表明,ITAC是CXCR3最強的激動劑;IP10具有較ITAC更顯著的抗血管作用。結構分析表明,趨化因子的N端和N-LOOP區(qū)是結合及活化受體的關鍵部位,主要通過C端結合在血管內皮細胞表面發(fā)揮抗血管生成的作用。我們實驗室的前期工作根據小鼠ITAC和IP10基因

3、序列設計構建了一個新的分子,由ITAC的N端、N-LOOP區(qū)與IP10的C端融合而成,命名為ITIP。計算機模擬結果表明:新分子ITIP能形成穩(wěn)定的趨化因子樣三維空間構象。我們期望ITIP功能上具有類似趨化因子的特性,更重要的是保留ITAC和IP10各自的功能優(yōu)勢,從而發(fā)揮更顯著的抗腫瘤作用。
　　為驗證我們的設想是否成立,本研究表達純化得到ITIP蛋白,通過體外功能實驗檢測其活性;在不同的腫瘤模型,觀察ITIP抗腫瘤效果;最后探

4、討ITIP的抗腫瘤機制。
　　第一部分新分子:ITIP的原核表達、純化及其特異性抗體制備
　　為了大量制備有活性的ITIP蛋白,我們采用原核系統(tǒng)表達融合蛋白的策略:在目的基因的N端融合硫氧還蛋白標記、6組氨酸標記以及編碼腸激酶特異識別多肽的堿基序列。硫氧還蛋白的融合表達,有助于提高表達產物的穩(wěn)定性;6組氨酸標記有利于后續(xù)融合蛋白的純化;腸激酶的識別位點便于酶切去除N端標簽蛋白得到ITIP目的蛋白。
　　我們首先以實驗室

5、前期構建的pcDNA3-ITIP載體為模板PCR擴增得到編碼ITIP成熟肽的基因片段,插入原核表達載體pET32a(+)構建pET32a-ITIP的重組質粒。將構建成功的pET32a-ITIP轉化大腸桿菌BL21(DE3)經異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導,結果在分子量27 Kda可見明顯的條帶,與預期的融合蛋白分子量大小一致(標簽蛋白約19 Kda,ITIP目的蛋白約8.7 Kda),提示成功誘導表達ITIP融合蛋白。

6、r>　　經蛋白表達條件優(yōu)化,最后確定0.1mM IPTG 37℃誘導4h為最適條件。SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白分布,結果融合蛋白在上清和包涵體均有表達,主要以可溶性形式表達。融合蛋白以鎳離子親和層析法純化,SDS-PAGE鑒定純度＞90％。低溫冷凍干燥濃縮融合蛋白后經二辛可寧酸(BCA)法蛋白定量,以重組腸激酶(rEK)酶切去除N端融合的標簽蛋白,再過鎳離子親和層析柱,收集穿透液得到ITIP蛋白。目的蛋白的Tr

7、icine-SDS-PAGE分析結果顯示,分子量8.7 Kda處可見明顯條帶,與ITIP蛋白預期分子量大小一致,純度＞90％。以ITAC的N端抗體、IP10的C端抗體分別進行Western blot鑒定ITIP蛋白,均可見單一條帶。以ITIP蛋白作為免疫原免疫新西蘭白兔,免疫后血清經飽和硫酸銨沉淀、QAE-Sephadex A50離子交換層析純化得到ITIP多克隆抗體(pAb)。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定效價為1:100 000

8、,Western blot鑒定得到單一條帶。
　　同時為后續(xù)動物實驗對照蛋白的需要,我們也構建了pET32a-ITAC及pET32a-IP10重組質粒,以相同條件誘導表達、純化相應蛋白,經Tricine-SDS-PAGE和Western blot鑒定,制備得到ITAC和IP10蛋白。
　　第二部分ITIP的體外功能特性鑒定
　　為確定構建表達的新分子ITIP是否具有趨化因子樣的功能特性,更重要的是檢測是否具有我們所期望

9、的ITAC更為優(yōu)勢的激動受體CXCR3的能力,及IP10更好的抗血管作用。我們分別應用趨化、受體內化、鈣離子內流實驗檢測ITIP是否保留了與ITAC類似的活性,應用血管內皮細胞的劃痕修復、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導的小鼠腹壁Matrigel種植體實驗鑒定ITIP是否具有與IP10相當?shù)囊种蒲苄纬傻奶匦浴?br>　　鑒于ITAC和IP10均為CXCR3的配體,而ITIP由ITAC和IP10的結構域組成,我們推測ITIP也通過

10、CXCR3受體發(fā)揮作用。已有的研究表明,CXCR3主要高表達在活化的T淋巴細胞表面,我們首先以熒光激活細胞分類術(FACS)確定Con A與IL-2刺激活化的淋巴細胞CXCR3的表達,然后應用此細胞檢測ITIP的趨化活性。結果顯示:1、10、100、1000ng/ml ITIP對活化的淋巴細胞均有不同程度的趨化作用,其中以100ng/ml趨化活性最強。以CXCR3阻斷抗體與活化淋巴細胞孵育后,再以100ng/ml ITIP進行趨化實驗,

11、結果趨化活性明顯受到抑制,提示ITIp對于CXCR3+淋巴細胞具有趨化活性。以市售的ITAC、IP10蛋白為對照,比較ITIP的趨化能力,結果表明濃度10、100、1000ng/ml ITIP的趨化活性與ITAC相當,較IP10顯著,也優(yōu)于ITAC與IP10聯(lián)合使用(P＜0.05),提示新分子基本保留了ITAC的N端和N-LOOP區(qū)的功能特性。
　　為進一步證實ITIP的活性,我們構建了pcDNA3.1-mCXCR3重組質粒,電轉

12、CHO細胞,經G418篩選,RT-PCR、FACS鑒定穩(wěn)定高表達mCXCR3的細胞株。然后分別應用活化的淋巴細胞、穩(wěn)定轉染mCXCR3的CHO(CHO/mCXCR3)細胞進行CXCR3受體內化實驗。結果與趨化實驗一致:ITIP與ITAC活性類似,在100ng/ml使細胞表面CXCR3表達降低55-65％,IP10使其降低30-35％,ITAC與IP10聯(lián)合使用降低35-40％。最后分別應用活化的淋巴細胞和CHO/mCXCR3細胞進行鈣離

13、子內流實驗進一步證實ITIP的活性:ITIP可引起短暫而迅速的鈣離子內流,ITIP、ITAC激發(fā)的平均熒光強度(MFI)高于IPIO、ITAC與IP10聯(lián)合使用所檢測到的MFI。通過上述幾種不同的檢測方法,我們均得到一致的結果,提示ITIP保留了ITAC的N端和N-LOOP區(qū)所具有的功能優(yōu)勢,具有與ITAC類似的更強的激動受體CXCR3的活性,優(yōu)于IP10單獨或與ITAC合用的效果。
　　血管內皮細胞劃痕修復實驗結果顯示:ITIP

14、對bFGF誘導血管內皮細胞遷移的抑制作用與IP10相當,遷移入劃痕區(qū)的細胞數(shù),較ITAC處理組明顯減少(P＜0.01),與ITAC和IP10簡單混合組比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),提示ITIP保留了IP10的功能特性。為進一步確證ITIP抑制血管的活性,我們采用檢測體內血管生成的常用方法Matrigel種植體技術,觀察ITIP對bFGF誘導的小鼠體內血管生成的抑制效果。
　　結果顯示:ITIP處理組與IP10處理組類似,與I

15、TAC處理組、ITAC與IP10聯(lián)合處理組比較,遷移入Matrigel種植體內的血管內皮細胞的數(shù)量減少,形成的血管管腔的數(shù)目降低,結果均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),提示ITIP保留了IP10更有效的抑制血管形成的作用。
　　總結以上結果:本研究構建表達的新分子ITIP是有生物活性的,更重要的是具有我們預期得到的ITAC和IP10各自的功能優(yōu)勢,可用于下一步的動物實驗研究。
　　第三部分ITIP在不同腫瘤模型中抗腫瘤效果研究

16、
　　本部分工作,旨在通過建立不同的腫瘤模型,觀察融合了ITAC和IP10功能優(yōu)勢的新分子ITIP是否可發(fā)揮更顯著的抗腫瘤的作用,有效抑制腫瘤的生長乃至促進腫瘤消退。
　　我們分別建立BALB/c小鼠CT26結腸癌、4T1乳腺癌和C57BL/6小鼠3LL肺癌三種腫瘤模型,應用ITIP蛋白腫瘤局部注射,同時以PBS、ITAC、IP10、ITAC聯(lián)合IP10蛋白治療組為對照。ITAC與IP10蛋白為第一部分制備得到的蛋白,經趨化

17、實驗、bFGF誘導的小鼠腹壁Matrigel種植體實驗鑒定與市售ITAC、IP10蛋白具有相近的活性。三種腫瘤模型的治療結果顯示:ITIP蛋白可抑制腫瘤生長,較。PBS對照組統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.001)。應用ITAC、IP10蛋白治療,可以延緩腫瘤的生長,一定程度上延長小鼠的生存期,結果與已有報道一致。應用ITIP蛋白治療,與單獨應用ITAC、IP10蛋白或是聯(lián)合應用兩種蛋白治療比較,能夠更為有效的抑制腫瘤生長、延長小鼠生存期,結果

18、均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。尤其在CT26結腸癌、4T1乳腺癌模型,具有明顯的抗腫瘤效果,ITIP治療組小鼠腫瘤完全消退,小鼠生存期明顯延長,90天依然100％存活。
　　同時我們觀察了ITIP蛋白可能對小鼠潛在的副作用,重要器官心、肝、脾、肺、腎的蘇木素-伊紅(H&E)染色結果顯示:各組織未見異常的形態(tài)學變化。ELISA檢測不同時間點收集的小鼠血清未檢測到抗ITIP的抗體。
　　第四部分ITIP抗腫瘤機制探討
　

19、　我們以CT26結腸癌模型為研究基礎,分別檢測各組治療后24h脾臟淋巴細胞亞群的比例變化、腫瘤局部的淋巴細胞浸潤、荷瘤小鼠細胞免疫應答水平及腫瘤局部的血管形成,初步探討ITIP可能的抗腫瘤機制。
　　首先基于已有的報道:應用趨化因子進行腫瘤局部治療,不僅可以抑制治療側腫瘤的生長,同時也可一定程度延緩遠側未治療腫瘤的生長。對ITIP也進行了同樣的檢測,結果發(fā)現(xiàn)ITIP治療具有這樣的作用。考慮ITIP局部治療可能激發(fā)了全身性的免疫應答

20、,我們應用FACS檢測各治療組脾臟淋巴細胞比例的變化。
　　結果顯示:ITIP治療組CXCR3+淋巴細胞比例與ITAC治療組比較無明顯差異,但較其它各組均有增加(P＜0.05)。對表達CXCR3的主要淋巴細胞亞群進行分析,發(fā)現(xiàn)其中CD3+T細胞增加最為顯著:Mψ、NK、DC細胞的比例變化各蛋白治療組之間比較無明顯差異。進一步檢測結果顯示:ITIP治療組CD4+和CD8+的淋巴細胞比例,與PBS、IP10、ITAC聯(lián)合IP10蛋白治

21、療組比較均有上調(P＜0.05)。腫瘤組織的H&E染色結果顯示:ITIP與ITAC治療組,可見大面積的壞死,大量的淋巴細胞浸潤;其他蛋白治療組只有散在的壞死灶和部分淋巴細胞浸潤。腫瘤組織的免疫熒光染色結果顯示:CXCR3+淋巴細胞浸潤明顯,其中CD3+T細胞為主,CD4+、CD8+的淋巴細胞均有不同程度浸潤,CD8+淋巴細胞浸潤更為明顯。腫瘤組織的CD31免疫熒光染色結果可見:ITIP與IP10治療組腫瘤的血管密度明顯降低,與其它各蛋白

22、治療組相比,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。荷瘤小鼠細胞免疫應答檢測結果:ITIP治療組脾臟淋巴細胞以腫瘤特異性抗原刺激后,體外增殖能力與ITAC組相當,較IP10、ITAC聯(lián)合IP10治療組增強;對CT26靶細胞的特異性殺傷活性增強,與IP10、ITAC聯(lián)合IP10治療組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示ITIP增強了機體細胞免疫應答水平。
　　綜上所述,基于ITAC和IP10的功能優(yōu)勢,通過理論預測而構建的新分子ITIP,不