大鼠脫細胞脊髓支架制備及相關性能的實驗研究.pdf

1、背景: 脊髓損傷近年來發(fā)病率有增高的趨勢并呈現(xiàn)出高發(fā)生率，高致殘率，高耗費，低死亡率的特點。組織工程學治療脊髓損傷是目前研究的熱點之一，它能整合治療研究的各種有效策略，誘導軸突再生并提供良好的三維通道，減少膠質瘢痕和空洞形成。支架是組織工程研究中的關鍵，目前尚無與脊髓三維結構高度相似且在理化性能也與脊髓相似的支架材料。 近年來一種新的趨勢是采用天然的脫細胞基質作為神經(jīng)組織的修復材料，即用同種異體來源的材料，采用脫細胞技術

2、制備的脫細胞基質，經(jīng)過去細胞、部分或完全去除有機質或無機質、去抗原等處理，形成生物衍生材料(bio-derived material)，用于組織工程研究。理論上講將脊髓組織進行脫細胞處理構建理想的組織工程支架是可行的，但目前尚無相關文獻報道。 目的: 通過采用物理凍融結合化學萃取方法初步構建大鼠脫細胞脊髓支架并優(yōu)化脫細胞方案，應用HE染色、髓鞘染色及掃描電鏡等方法評價制備脫細胞脊髓支架的可行性，然后通過對支架的成分分析、

3、免疫原性分析、細胞毒性、組織相容性，血液相容性、全身毒性反應等檢測評價脫細胞脊髓支架的生物安全性，并將神經(jīng)干細胞與支架復合，觀察細胞在支架材料上的生長情況，評價支架材料的細胞相容性，從而為構建理想的組織工程脊髓支架提供實驗基礎。 方法: 1.脫細胞方案的確定：采用凍融結合化學萃取方法制備脫細胞脊髓支架，并應用HE染色、髓鞘染色及掃描電鏡等方法檢測脫細胞效果以確定最合適脫細胞方案。 2.脫細胞脊髓支架成分分析及免疫

4、原性檢測：應用免疫組織化學方案分析支架可能存在的成分；將脫細胞脊髓支架及同種異體脊髓組織分別進行大鼠椎旁皮下埋植后，于術后1w，2w，3w，4w周取材檢測免疫排斥反應情況(免疫組織化學方法)，評價免疫原性。 3.脫細胞脊髓支架細胞毒性及全身毒性研究：通過浸提液與細胞共培養(yǎng)評價細胞毒性；通過溶血試驗、凝血時間測定評價血液相容性；通過熱原試驗、全身毒性反應評價支架的全身毒性。 4.脫細胞脊髓支架復合神經(jīng)干細胞體外組織工程脊髓

5、構建研究：將神經(jīng)干細胞以不同濃度梯度接種在脫細胞脊髓支架上進行聯(lián)合培養(yǎng)，觀察細胞存活情況，比較不同接種密度上架細胞黏附率(Adhesive rate)，繪制生長曲線。 免疫組化結果用生物醫(yī)學圖像分析儀行平均光密度(AOD)分析，以重復資料的方差分析、t檢驗統(tǒng)計結果。 結果及結論: 1、用凍融結合化學萃取法構建脫細胞脊髓組織工程支架是可行的，該支架具有良好的三維網(wǎng)狀結構，脫細胞徹底，細胞外基質得到保存； 2

6、.構建的脫細胞脊髓支架材料為三維網(wǎng)狀結構，具有相互溝通的孔隙，其孔徑為6-150μm，孔隙率平均為(93.6±1.5)％，含水能力平均為(58.2±1.6)％。初步顯示出支架材料具有良好的結構性能； 3.構建的脫細胞脊髓支架材料含有Ⅳ型膠原、LN，F(xiàn)N等對細胞黏附、增殖、分化有利的活性成分，植入大鼠皮下后，未引發(fā)明顯的炎性細胞浸潤顯示出支架具有極低的免疫原性； 4.構建的支架材料對體外NIH3T3細胞的生長、增殖及代謝無