轉錄因子SOX2通過PTEN-Rb途徑抑制胃癌細胞增殖與轉移.pdf

1、【背景】:
　　胃癌(GastricCarcinoma)的發(fā)病率在中國位于惡性腫瘤的第二位。迄今為止,其病因及發(fā)生的分子機制仍不清楚。SOX2作為一個控制胚胎器官發(fā)育的轉錄因子被廣泛研究,特別因為能與其它的轉錄因子協(xié)同作用,使體細胞逆分化為IPS細胞而變得非常著名。它除了參與干細胞全能性的維持、胚胎的發(fā)育外,在神經(jīng)系統(tǒng)、胃的器官發(fā)育、維持胃上皮細胞的表型和功能等方面也發(fā)揮著關鍵作用。研究表明,SOX2表達下降和丟失可能與胃癌的發(fā)生

2、、發(fā)展密切相關。但由于使用檢測方法、組織來源以及研究目的不同等原因,使得既往有關SOX2在胃癌中的表達及其與胃癌臨床病理參數(shù)間關系的研究結果不太一致。因而SOX2在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律、作用機制以及與臨床預后之間的關系值得進一步的探索與深究。
　　【目的】:
　　SOX2是胃發(fā)育特異性轉錄因子,其異常表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究旨在探討SOX2在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中不同病理階段的表達變化及其臨床意義,以及S

3、OX2對胃癌細胞惡性表型的影響及其分子機制。
　　【方法】:
　　1.用免疫組化方法檢測32例正常胃粘膜,162例慢性淺表性胃炎,122例慢性萎縮性胃炎(或伴腸化/低級別上皮內瘤變),378例胃腺癌,61例胃癌轉移灶中SOX2蛋白的表達水平;用WB、qRT-PCR檢測從西京消化病醫(yī)院病理科獲得的10例胃癌及癌旁組織新鮮冰凍手術切除標本中SOX2的表達;分析SOX2在胃癌進程各病理階段組織中的表達,并總結其與胃癌臨床病理參數(shù)的

4、關系;
　　2.構建SOX2過表達的慢病毒表達載體及其陰性對照載體,使SOX2過表達,感染MKN28胃癌細胞。通過WST-1,裸鼠成瘤實驗及Ki67免疫組化染色分別檢測SOX2在體內與體外對胃癌細胞生長增殖的影響;
　　3.通過流式細胞術及組織細胞凋亡小體染色檢測細胞周期和凋亡的變化;
　　4.通過Transwell遷移、侵襲實驗以及裸鼠尾靜脈注射內臟轉移實驗分別在體外和體內研究SOX2對胃癌細胞侵襲轉移能力的影響;<

5、br>　　5.通過ChIP-GLS和表達譜芯片技術篩選SOX2可能作用的靶基因,并用生物信息學分析鎖定SOX2作用的靶基因,后進一步用ChIP-PCR、EMSA、熒光素酶報告基因實驗等技術進行驗證;
　　6.在SOX2高表達的胃癌細胞系中采用預測靶基因敲除技術建立功能缺失模型驗證預測的靶基因是否可拮抗SOX2高表達后產(chǎn)生的惡性生物學行為;
　　7.用WB法檢測胃癌細胞中SOX2高表達前后相應預測靶基因表達水平的變化,并用免疫

6、組化方法檢測這種表達變化關系對胃癌臨床預后判斷的重要意義。
　　【結果】:
　　1.SOX2的表達水平與胃癌發(fā)生進程中臨床病理參數(shù)的分析結果提示,SOX2在正常胃粘膜、腸化、不典型增生、胃癌以及轉移灶中表達逐漸降低。SOX2的表達降低與胃癌的分化程度、TNM分期及患者預后密切相關,并可作胃癌患者預后的獨立預測指標。
　　2.與對照細胞相比,在胃癌細胞中高表達SOX2后,WST-1、裸鼠成瘤實驗及Ki67免疫組化染色結果

7、表明胃癌細胞生長減慢;流式細胞術及組織細胞凋亡小體染色顯示細胞凋亡增加;Transwell遷移、侵襲實驗以及裸鼠尾靜脈注射內臟轉移實驗均提示胃癌細胞的侵襲和轉移能力減弱;但細胞周期無明顯變化。
　　3.ChIP-GLS技術發(fā)現(xiàn),胃癌細胞中有718個蛋白質編碼基因的啟動子能與SOX2結合;表達譜芯片結果顯示,SOX2過表達后細胞差異表達的基因有320個。取兩者的交集,共有11個基因,其中2個表達上調,9個表達下調。生物信息學分析表明

8、,PTEN作為表達上調的基因可能是SOX2直接調控的靶基因。
　　4.ChIP-PCR、EMSA、熒光素酶報告基因實驗以及一系列功能學實驗技術證實,SOX2通過上調PTEN,PTEN使Rb去磷酸化來抑制胃癌細胞生長增殖,阻止胃癌細胞凋亡,并削弱其侵襲遷移能力,而對細胞周期并未產(chǎn)生影響。
　　5.用免疫組化檢測SOX2、PTEN、Rb在203例癌/癌旁配對組織中表達,結果發(fā)現(xiàn)SOX2與PTEN的表達正相關,與pRb的表達負相關

9、。SOX2與PTEN、Rb聯(lián)合在判斷胃癌預后中有重要臨床意義,根據(jù)SOX2、PTEN的表達情況,將胃癌患者分為SOX2(+)PTEN(+),SOX2(+)PTEN(-),SOX2(-)PTEN(+),SOX2(-)PTEN(-)四組,結果提示SOX2、PTEN表達同時降低,Rb表達升高的患者其預后更差。
　　【結論】:
　　1.SOX2在胃癌前病變中已發(fā)生顯著的表達降低,SOX2表達降低是胃癌發(fā)生過程中的早期事件。SOX2的