抑制人肝癌7721細胞中N-糖鏈加工酶引起細胞內質網應激及其誘導細胞凋亡的機制研究.pdf

1、內質網是一種重要的真核細胞器，它是分泌性蛋白質及膜蛋白正確折疊及聚合的場所，還是細胞內重要的鈣離子貯存庫，糖蛋白的糖基化也開始于其中。因此保持內質網穩(wěn)態(tài)是維持細胞生理正常的重要因素。由于葡萄糖或氨基酸饑餓、細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)改變以及其他各種原因導致的內質網中蛋白質糖基化或二硫鍵形成受阻或其它原因會引起內質網中未折疊或錯誤折疊的蛋白質的堆積，從而引發(fā)未折疊蛋白質反應(unfoldedproteinresponse，UPR)，導致內質網應激(

2、ERstress)。處于內質網應激狀態(tài)的細胞表現出伴侶蛋白基因表達上調、泛蛋白．蛋白酶體途徑的基因表達上調、蛋白質合成受抑制等特征。細胞正是通過產生UPR-ERstress減少需要折疊的蛋白質來源，加強蛋白質的折疊及清除內質網中積累的未折疊蛋白，使細胞在內外環(huán)境不利的情況下仍能存活。如果嚴重情況下細胞產生UPR-ERstress仍不能克服內質網中不斷積累的未折疊蛋白質，則內質網應激可誘導細胞凋亡。 人體內的蛋白質至少有1／3以上

3、是糖蛋白，存在于各種組織和不同細胞中，具有非常重要的功能。由內質網合成并輸送到高爾基體、溶酶體、細胞膜和細胞外的蛋白質多數是糖蛋白。糖蛋白根據糖鏈結構不同主要分成O-聚糖和N-聚糖兩種。N一聚糖在細胞總體糖蛋白中的合成是一個共翻譯(co-translation)過程，隨著翻譯的進行肽鏈延伸進入內質網腔，N．聚糖可被位于內質網腔膜結構上的加工酶修飾加工至高甘露糖型，再進入高爾基體，繼續(xù)被加工合成。 糖蛋白N．糖鏈的生物合成是由粗面

4、內質網上的一種十四寡糖在糖基轉移酶的催化下轉移到天冬酰胺上，形成N一連接寡糖。內質網中的Q．葡萄糖苷酶I和II切除該寡糖鏈的3分子葡萄糖，α-甘露糖苷酶再切除1分子甘露糖，形成高甘露糖型的N-糖鏈。高甘露糖型的N-糖鏈進入高爾基體被其中的α-甘露糖苷酶I水解掉3分子甘露糖后，繼續(xù)被高爾基體中的其它酶修飾，形成雜合型及其復雜型N．糖鏈。糖蛋白N．糖鏈的合成是一個連續(xù)的酶促反應，其中任何酶的缺失或異常都將引起N一糖鏈合成異常，甚至導致其它細

5、胞反應。 內質網以及高爾基體中的Q．甘露糖苷酶I是一個非常重要的N．糖鏈加工酶，它是控制高甘露糖型N．糖鏈向雜合型及復雜型N．糖鏈轉化的關鍵酶。一旦其功能發(fā)生障礙，可能引起各種類型N．糖鏈，包括高甘露糖型、雜合型及復雜型糖鏈的合成異常。過去對甘露糖苷酶的研究主要集中在參與酵母蛋白和一些跨膜蛋白的降解中。而本文針對在人肝癌772l細胞特異性抑制α-甘露糖苷酶I，是否會引起內質網應激進行研究。DMJ(1-deoxymannojh-i

6、mycin)，1．脫氧甘露糖吉利霉素是高爾基體中的α-甘露糖苷酶I的特異性抑制劑，本論文研究發(fā)現，DMJ可以使人肝癌7721細胞發(fā)生內質網應激，表現為伴侶蛋白GRP78、轉錄因子CHOP(C／EBPhomologusprotein)表達上調，轉錄因子XBPl剪接激活及caspase-12剪切激活。 N．乙酰氨基葡萄糖基轉移酶V(N-acetylglucosaminyltransferaseV，GnT-V)是另一種分布在高爾基體中

7、的一種重要的N-糖鏈加工酶，它以UDP-GlcNAc為供體底物，催化C2C2七糖二天線階段或C2C2，4八糖三天線階段的N糖鏈分別形成C2C2，6及C2，4C2，6三天線及四天線N糖鏈。GnT-V與惡性細胞的N一糖鏈變化關系密切，在腫瘤的形成及發(fā)展過程中起著非常重要的作用。本實驗采用GnT-V反義cDNA質粒轉染SMMC7721細胞的方法，獲得穩(wěn)定表達株ASGnT-V7721。而且，內質網應激標志性分子GRP78和XBPl及PERK的變