視神經(jīng)脊髓炎及多發(fā)性硬化關(guān)聯(lián)基因FcRL3的表達(dá)研究.pdf

1、第一部分視神經(jīng)脊髓炎及多發(fā)性硬化關(guān)聯(lián)基因FcRL3的表達(dá)研究
　　目的：
　　與疾病關(guān)聯(lián)的基因多態(tài)性可能增加了疾病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素，但是更重要的是認(rèn)識(shí)這種多態(tài)性位點(diǎn)如何改變基因及細(xì)胞的功能，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制。在本課題組的前期研究中，我們發(fā)現(xiàn) FcRL3基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群NMO和MS相關(guān)聯(lián)。在這部分，我們將進(jìn)一步探討FcRL3基因多態(tài)性與NMO及MS患者發(fā)病的關(guān)系，特別是FcRL3基因表達(dá)與臨床用藥及患者病

2、程不同時(shí)期之間的關(guān)系；同時(shí)構(gòu)建表達(dá)有FcRL3的體外模型Jurkat細(xì)胞，觀察NMO和MS的急性期治療藥物甲強(qiáng)龍對(duì)FcRL3表達(dá)水平的影響。初步探討FcRL3基因在NMO和MS發(fā)病過程中的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1、收集臨床確診的MS組56例，NMO組57例以及正常對(duì)照77例。其中MS組中收集患者血液標(biāo)本62份，包括部分患者不同用藥時(shí)期的外周血：急性期13例，緩解期5例；NMO組收集患者血液標(biāo)本98份，其中部分患者采集不

3、同用藥時(shí)期的外周血：用藥前（急性期）、用藥中（急性期）、用藥后（緩解期），包括急性期67例，緩解期31例；正常對(duì)照的血液標(biāo)本77份。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)患者及正常對(duì)照標(biāo)本外周血FcRL3 mRNA的表達(dá)。
　　2、收集Jurkat細(xì)胞株，驗(yàn)證Jurkat細(xì)胞株高表達(dá)FcRL3蛋白。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) Jurkat細(xì)胞株不同用藥時(shí)期 FcRL3 mRNA的表達(dá)；采用Western-blottin

4、g蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同用藥時(shí)期Jurkat細(xì)胞株上 FcRL3蛋白的表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)激素對(duì)Jurkat細(xì)胞上FcRL3表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、FcRL3 mRNA在患者中的表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照FcRL3的表達(dá)量（p<0.05）；不管是在MS患者還是NMO患者。在NMO組中，患者急性期的表達(dá)量明顯低于在緩解期的表達(dá)量（p<0.05）。
　　2、在MS組中，不同基因型表達(dá)存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，CC

5、基因型FcRL3 mRNA較其他基因型明顯增高（CC vs CT，P=0.014；CC vs TT，p=0.005），在NMO組中，不同基因型FcRL3mRNA表達(dá)存在著明顯差異（CT vs TT，p=0.038）；然而，在正常對(duì)照中，不同基因型的FcRL3 mRNA表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于相同基因型 TT，NMO組的FcRL3 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組（p=0.000），同時(shí)，MS組的FcRL3 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組（p=0

6、.001）；對(duì)于相同基因型CT，NMO組（p=0.004）和MS組（p=0.009）的FcRL3 mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組；對(duì)于相同基因型CC，NMO組和MS組的FcRL3 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、在NMO組中，可觀察到同一病人在激素不同用藥時(shí)期（用藥前—用藥中—用藥后）出現(xiàn)外周血FcRL3 mRNA表達(dá)不同趨勢(shì)，表現(xiàn)為使用激素后FcRL3表達(dá)抑制，緩解期FcRL3 mRNA表達(dá)升高的趨勢(shì)。

7、　　4、NMO患者病程的不同時(shí)期（急性期—緩解期），不同病程 FcRL3 mRNA表達(dá)存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，緩解期較急性期 FcRL3基因表達(dá)明顯增高（p=0.045）；在MS組中，患者臨床病程的不同時(shí)期（急性期－緩解期），F(xiàn)cRL3 mRNA表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.297）。
　　5、經(jīng)驗(yàn)證Jurkat細(xì)胞上FcRL3蛋白高表達(dá)。Jurkat細(xì)胞上FcRL3蛋白的表達(dá)在不同濃度激素干預(yù)時(shí)有量的差異，在0.25mg甲強(qiáng)龍干預(yù)

8、水平，Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)抑制但不致死，故0.25mg為最適用藥濃度。
　　7、Jurkat細(xì)胞在0.25mg激素干預(yù)的不同用藥時(shí)期（24h-48h），出現(xiàn)使用激素后FcRL3表達(dá)抑制，用藥后一定時(shí)間FcRL3 mRNA表達(dá)升高的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1、FcRL3基因與中國(guó)漢族人群NMO和MS均具有相關(guān)性。
　　2、在中國(guó)漢族人群NMO和MS患者中，F(xiàn)cRL3基因 rs7528684位點(diǎn)作為啟動(dòng)子及其近側(cè)區(qū)域

9、可結(jié)合控制轉(zhuǎn)錄起始的元件，影響外周血 FcRL3轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)FcRL3基因的表達(dá)。
　　3、外周血單個(gè)核細(xì)胞的FcRL3 mRNA在NMO和MS緩解期表達(dá)增高，推測(cè)其可能是一種保護(hù)性反應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
　　4、藥物干預(yù)后，Jurkat細(xì)胞上FcRL3表達(dá)呈劑量時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，推測(cè)FcRL3基因在免疫調(diào)節(jié)中的準(zhǔn)確作用和在胞內(nèi)信號(hào)通路中起著一定的作用。
　　第二部分ATG5基因多態(tài)性與中國(guó)南方漢族人群視神經(jīng)脊髓

10、炎相關(guān)性的研究
　　目的：
　　視神經(jīng)脊髓炎（Neuromyelitis Optica，NMO）和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘性的自身免疫性疾病。視神經(jīng)脊髓炎，以往被視為多發(fā)性硬化的一種特殊亞型。自從NMO的自身特異性抗體NMO-IgG的發(fā)現(xiàn)，人們才把 NMO從 MS中獨(dú)立出來。近來，自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene,ATG5）發(fā)現(xiàn)與許多的

11、自身免疫性疾病和炎性疾病發(fā)病相關(guān)。ATG5在T細(xì)胞上表達(dá)的增加可能參與了MS病人的炎性脫髓鞘過程。然而目前國(guó)內(nèi)外尚未見有關(guān)ATG5基因多態(tài)性與NMO及MS發(fā)病相關(guān)性的報(bào)道。本研究主要對(duì)自噬相關(guān)基因5(ATG5)基因多態(tài)性和視神經(jīng)脊髓炎以及多發(fā)性硬化的疾病易感性進(jìn)行探討。
　　方法：
　　收集2007-2012年復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院和福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院及門診確診的視神經(jīng)脊髓炎患者109例，多發(fā)性硬化患者144例,

12、健康對(duì)照288例，采用MassArray對(duì)病例組及健康對(duì)照組進(jìn)行ATG5基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性分析。
　　結(jié)果：
　　1、NMO組rs548234的CC基因型與正常對(duì)照組相比具有明顯意義（P=0.016），同時(shí)進(jìn)一步比較NMO-IgG陽性的NMO組與正常對(duì)照組，我們發(fā)現(xiàn)rs548234位點(diǎn)T等位基因（P=0.003）和rs6937876位點(diǎn)的A等位基因（P=0.003）是一種保護(hù)因素。MS組ATG5的5個(gè)SNP位

13、點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與正常對(duì)照組相比較不存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；
　　2、NMO組中，rs548234的CC基因型增加疾病易感性(p=0.016)；
　　3、在NMO-IgG(+)的NMO患者中,rs548234(p=0.003)位點(diǎn)的T等位基因和rs6937876(p=0.009)位點(diǎn)的A等位基因?yàn)槠浔Ｗo(hù)因素；
　　4、我們并沒有發(fā)現(xiàn)ATG5基因多態(tài)性與MS的發(fā)病存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：