KRAB型鋅指蛋白PITA和PISA轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析及SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA合成調(diào)控的研究.pdf

1、p53作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，響應(yīng)多種細胞信號的應(yīng)激，從而調(diào)控下游不同的靶基因維持細胞的穩(wěn)定。以往的研究主要關(guān)注p53對細胞周期阻滯和凋亡的調(diào)控，近年來p53相關(guān)代謝的靶基因的研究成為熱點，研究表明p53可以通過轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因TIGAR和SCO2的表達抑制糖酵解，促進氧化磷酸化。隨著對p53參與代謝調(diào)控研究的深入，p53的上游分子如何參與代謝靶基因的選擇性調(diào)控，從而最終決定細胞的命運成為研究的新方向。
　　在哺乳動物中KRAB型鋅

2、指蛋白分子（KZNF）組成了最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，大量的研究發(fā)現(xiàn)KZNF蛋白表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制效應(yīng)，參與細胞的增殖、凋亡及代謝等調(diào)控過程。Apak（ATM and p53 associated KZNF protein）是實驗室前期在該家族中鑒定到新的p53負調(diào)控因子，能夠選擇性調(diào)控p53相關(guān)的凋亡靶基因的表達，而對細胞周期阻滯沒有明顯影響。KZNF家族分子功能結(jié)構(gòu)域比較保守，那么該家族是否還有其它分子參與p53介導的代謝相關(guān)靶基因的選擇

3、性調(diào)控，目前尚無報道。
　　分子實驗研究發(fā)現(xiàn)，KZNF蛋白家族中兩個分子KZNF475和KZNF568能夠抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性，且能夠與p53結(jié)合；KZNF475特異性抑制p53下游靶基因TIGAR的表達，因此將其命名為PITA（p53 inhibitor on TIGARactivation），KZNF568特異性抑制p53下游靶基因SCO2的表達，因此將其命名為PISA（p53 inhibitor onSCO2 activat

4、ion）。TIGAR抑制糖酵解中的限速酶磷酸果糖激酶1（PFK1）的活性抑制糖酵解并促進磷酸戊糖旁路途經(jīng)；SCO2促進細胞色素c氧化酶復合體的組裝并對酶活性有重要的調(diào)控作用。在細胞學水平檢測發(fā)現(xiàn)PITA選擇性的抑制TIGAR的表達，促進細胞糖酵解進程；PISA選擇性的抑制p53對SCO2的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制氧化磷酸化。p53感應(yīng)不同程度的應(yīng)激從而做出相應(yīng)的細胞學反應(yīng)，當在輕微的損傷應(yīng)激下PITA解除了對p53的抑制，促進細胞的修復存活。

5、在嚴重損傷應(yīng)激下，PISA與p53發(fā)生解離，使得p53下游的SCO2被激活，誘發(fā)細胞的死亡。
　　本研究首先成功構(gòu)建了PITA、PISA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并利用該模型從動物體內(nèi)水平進一步驗證PITA與PISA對糖酵解通路及線粒體氧化磷酸化通路的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)PITA轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織中PFK1的活性較野生型小鼠明顯升高，葡萄糖的消耗以及乳酸的生成增加，表明小鼠體內(nèi)糖酵解速率增強；進一步檢測發(fā)現(xiàn)PITA轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NADPH的水平

6、降低，表明小鼠體內(nèi)還原力降低；PITA轉(zhuǎn)基因小鼠整體代謝水平低于野生型小鼠。與野生型小鼠比較發(fā)現(xiàn)PISA轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌組織和腎臟中細胞色素C氧化酶活性降低，能量的代謝傾向于通過糖酵解途經(jīng)；PISA轉(zhuǎn)基因小鼠的整體代謝水平低于野生型小鼠。
　　當 p53缺失時，ATP的產(chǎn)生的主要方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒舛钦５难趸姿峄窘?jīng)，這一現(xiàn)象在腫瘤細胞中稱為Warburg效應(yīng)。對能量代謝的調(diào)控是p53發(fā)揮抑制腫瘤的重要功能。通過多器官癌的篩選發(fā)

7、現(xiàn)，PITA、PISA在食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌和肺癌中都有較高的表達，其中結(jié)直腸組織的癌和癌旁表達差異最為明顯，通過75例結(jié)直腸癌臨床樣本分析表明PITA、PISA的表達癌高于癌旁，具有顯著性差異。
　　綜上，本研究首次建立PITA和PISA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，獲得了關(guān)于PITA和PISA基因生理功能的證據(jù)，發(fā)現(xiàn)了PITA和PISA分別在糖酵解通路和線粒體氧化磷酸化通路中發(fā)揮重要的選擇性調(diào)控功能，并且初步探討了PITA和

8、PISA與結(jié)直腸癌的相關(guān)性。
　　核糖體是由核糖體RNA和核糖體蛋白組成的復合體，其功能是參與蛋白質(zhì)合成。SUMO化修飾對底物蛋白的定位及活性有重要的調(diào)控作用，前期研究發(fā)現(xiàn)在核仁應(yīng)激下ARF促進Apak發(fā)生SUMO化修飾并使其入核仁。為了進一步探討SUMO化修飾的KRAB型鋅指蛋白Apak對核糖體RNA合成的調(diào)控功能,本研究通過Northern Blot檢測SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA合成的影響；通過運用實時定量PCR檢

9、測SUMO化修飾的Apak對核糖體RNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；采用RNA-ChIP方法檢測核糖體RNA與Apak蛋白的相互作用，結(jié)果表明：SUMO化修飾的Apak抑制47S核糖體RNA前體的合成，主要抑制RNA聚合酶Ⅰ介導轉(zhuǎn)錄的18S和5.8S rRNA，另外在放線菌素D以及原癌基因Ras V12激活條件誘導下促進Apak與18S、5.8S核糖體RNA相互作用。本次研究為理解Apak的功能和作用機制提供了新的依據(jù),為深入研究KRAB型鋅指蛋白