基于生物網(wǎng)絡調(diào)控下丹參抗腫瘤血管生成研究——隱丹參酮誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的機制研究.pdf

1、腫瘤血管生成是腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的重要過程。作為血管生成的基礎單元，血管內(nèi)皮細胞在多種促血管生成因子的作用下，會不斷增殖，促使腫瘤血管網(wǎng)絡的不斷擴張。目前，多種治療策略就是靶向血管內(nèi)皮細胞，抑制血管內(nèi)皮細胞在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮作用。隱丹參酮是丹參脂溶性醌類化合物之一。前期有關隱丹參酮抗腫瘤的整體實驗發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮具有顯著的抑制腫瘤血管生成的能力。此實驗結果已經(jīng)被多個課題組所證實。然而，隱丹參酮的抗腫瘤血管的作用機制鮮有報道。鑒于此，本課

2、題選擇隱丹參酮來研究其對血管內(nèi)皮細胞的作用及其具體的作用機制。
　　本研究首先是采用血管內(nèi)皮細胞的管腔形成實驗、大鼠動脈環(huán)的血管生成實驗和B16F10荷瘤小鼠的瘤內(nèi)血管生成實驗，從細胞、離體和整體動物三方面來考查隱丹參酮對腫瘤血管生成的影響。以隱丹參酮(Cryptotanshinone)為檢索詞，通過Cytoscape軟件篩選到隱丹參酮調(diào)控血管生成的可能靶點或通路，即主要與誘導胞內(nèi)ROS超載的凋亡、抑制MAPK信號通路及Bcl-2

3、蛋白家族等有關。采用MTT法、流式細胞儀、Western blot考查隱丹參酮對血管內(nèi)皮細胞的作用，結果表明隱丹參酮能劑量依賴性和時間依賴性地抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，且主要與其誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡有關。進一步的研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡主要與其促進線粒體中細胞色素C的釋放，激活內(nèi)源性線粒體凋亡信號通路有關。檢測不同時間點隱丹參酮對細胞色素C釋放的影響，發(fā)現(xiàn)隱丹參酮作用6h后，就能在胞漿中檢測到細胞色素C。使用線粒體膜通透性轉(zhuǎn)

4、運孔的特異性抑制劑—環(huán)孢菌素A，發(fā)現(xiàn)在同樣時間點即6h時，仍能檢測到細胞色素C的釋放。表明隱丹參酮作用6h時引起的細胞色素C的釋放并不是由線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放引起的;通過檢測線粒體外膜機械性損傷相關指標Ca2+濃度和ROS的水平發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮作用6h時并不會引起細胞中Ca2+濃度和ROS水平的超載和線粒體的超微結構的損傷，即進一步排除了隱丹參酮通過引發(fā)線粒體外膜機械性損傷誘導細胞色素C的釋放;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隱丹參

5、酮作用6h時能顯著抑制Bcl-2和Bcl-xl的表達，升高Bax和BimEL的表達。其中，BimEL的變化最為明顯;采用siRNA沉默Bim表達發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮誘導細胞色素C的釋放受到了一定程度的影響;Bim的沉默并不影響血管內(nèi)皮細胞的增殖活性和管腔形成能力，初步表明隱丹參酮作用6h引起的細胞色素C的釋放與線粒體外膜上特異性通道的形成有關，且主要與促凋亡蛋白Bim有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮能促進血管內(nèi)皮細胞中BimEL與Bax蛋白相互

6、結合形成復合物，再同線粒體外膜VDAC結合，進而來調(diào)控細胞色素C的釋放。
　　以上結果表明，隱丹參酮促進血管內(nèi)皮細胞中BimEL與Bax蛋白相互結合形成復合物，再同線粒體外膜VDAC結合，調(diào)控線粒體中細胞色素C釋放到胞漿，進而激活內(nèi)源性線粒體凋亡信號通路，最終誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用。
　　在正常成年人的血管中，絕大部分血管內(nèi)皮細胞都處于靜息期。那么，隱丹參酮是否對靜息期的血管內(nèi)皮細胞有作用？為排除這一