抗菌藥物聯合應用縮小細菌耐藥突變選擇窗的研究.pdf

1、細菌耐藥是一個極為復雜的問題，應該從多個方面給與重視，其中臨床上給藥劑量的不規(guī)范是導致細菌耐藥的一個重要因素。1999年突變選擇窗理論的提出恰恰解決了這一問題，該理論認為：耐藥突變體亞群在應用抗菌藥物治療之前已經存在，而在應用抗菌藥物治療時，如果抗菌藥物的濃度位于突變選擇窗(mutant selection window, MSW)之間，耐藥突變體會選擇性富增，MSW的上界值為防耐藥突變濃度(mutant prevention conc

2、entration，MPC)。因此，關閉或者縮小MSW可以較少細菌發(fā)生耐藥突變的機會。當兩種不同作用機制的抗菌藥物聯合應用，并同時處于各自的MIC之上時，細菌需要同時發(fā)生兩種耐藥突變才能生長從而關閉MSW，從而有效控制細菌耐藥。目的
　　 在體外和動物體內探討抗菌藥物的聯合應用能否縮小細菌對單藥的耐藥突變選擇窗，能否有效控制細菌耐藥。同時觀察突變選擇窗內細菌的耐藥機制。
　　 方法：
　　 1.體外試驗：選擇銅綠

3、假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌三種細菌的標準菌株進行試驗。
　　 1.1銅綠假單胞菌：選擇頭孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)和環(huán)丙沙星(CIP)為試驗藥物，分別應用瓊脂平板稀釋法和棋盤格法測定單藥以及兩兩聯合聯合之后的MIC。瓊脂平板稀釋法測定單藥及兩兩聯合時對銅綠假單胞菌的防耐藥突變濃度MPC，并計算選擇指數SI(MPC/MIC)，觀察能否縮小突變選擇窗。
　　 1。2金黃色葡萄球菌：分別應用E-test與瓊

4、脂平板稀釋法測定萬古霉素對金黃色葡萄球菌的MIC與MPC，同時應用棋盤格法和瓊脂平板稀釋法測定聯合左氧氟沙星與利福霉素后萬古霉素的MIC與MPC，并計算選擇指數SI，觀察能否縮小突變選擇窗。
　　 1.3大腸埃希菌：選擇環(huán)丙沙星(CIP)與阿米卡星(AMK)為試驗藥物，分別應用瓊脂平板稀釋法和棋盤格法測定單獨以及聯合之后的MIC，瓊脂平板稀釋法測定單獨及聯合時對大腸埃希菌的防耐藥突變濃度MPC，并計算相應的選擇指數SI，觀察能否

5、縮小突變選擇窗。
　　 2.耐藥機制的初步分析：選擇銅綠假單胞菌為代表，觀察主動外排系統(tǒng)在突變選擇窗內細菌耐藥所起的作用。2.1 E-test測定美羅培南(MEM)、頭孢他啶(CAZ)、阿米卡星(AMK)、環(huán)丙沙星(CIP)四種抗銅綠假單胞菌藥物單藥MIC。2.2棋盤格法測定聯合利血平、奧美拉唑、阿奇霉素、CCCP、PaβN五種外排抑制劑后抗菌藥物對銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度MIC。2.3瓊脂平板二倍稀釋法測定抗菌藥物單藥以及聯

6、合外排抑制劑后防耐藥突變濃度(MPC)，并計算相應的選擇指數SI。同時用美羅培南、頭孢他啶、環(huán)丙沙星分別聯合阿米卡星，阿米卡星聯合環(huán)丙沙星，分別測定聯合前后的SI，比較聯合抗菌藥物與聯合外排抑制劑在防銅綠假單胞菌耐藥突變的能力，分析主動外排系統(tǒng)在突變選擇窗內細菌耐藥所起的作用。
　　 3.動物實驗：在家兔體內觀察環(huán)丙沙星聯合妥布霉素后，能否降低環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌的防耐藥突變濃度，控制細菌耐藥。
　　 3.1、建立兔組

7、織籠感染模型；
　　 3.2、高效液相色譜法測定環(huán)丙沙星在兔組織液中藥代動力學參數；
　　 3.3、試驗分組：55只家兔隨機分為11組，1組為生理鹽水組最為對照，5個組為單用環(huán)丙沙星，其余5個組為環(huán)丙沙星聯合妥布霉素，每組5只家兔。每只均注入1010cfu/m1濃度的銅綠假單胞菌ATCC278531m1，
　　 3.4、給藥方案：環(huán)丙沙星按照藥代動力學參數設計給藥方案，一天內10次給藥，每次給藥間隔2小時，使單藥

8、組與聯合組家兔血環(huán)丙沙星穩(wěn)態(tài)濃度分別均達到1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC濃度，聯合組妥布霉素給藥方案參照參考文獻，是其穩(wěn)態(tài)濃度均達到其2-4MIC濃度，治療三天，抽取組織液，稀釋后涂布瓊脂平板，觀察耐藥突變體生長情況。
　　 結果：
　　 1、體外實驗：
　　 1，1、銅綠假單胞菌：CIP、AMK、CAZ單藥對銅綠假單胞菌的SI分別為16、16、＞32。兩兩聯合后各自單藥的SI分別為：CIP+

9、AMK(CIP-8：AMK-4)：CIP+CAZ(CIP-4;CAZ-8);AMK+CAZ(AMK-8:CAZ-4)。1.2、金黃色葡萄球菌：萬古霉素對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MIC、MPC以及SI分別為1.0μg/mL、51.2μg/mL、51.2，萬古霉素分別聯合利福霉素與左氧氟沙星后的MPC及SI分別為12.8μg/mL、25.6；8.0μg/mL、16.0。1.3、大腸埃希菌：CIP、AMK單藥對大腸埃希菌的SI分別為

10、16和32。兩者聯合應用時，當AMK濃度達到2MIC、CIP達到其2MIC時便可抑制耐藥突變體產生。聯合后的SI分別為8(0.008/0.001)和8(2/0.25)。2、耐藥機制的初步分析：MEM、CAZ、AMK、CIP四種抗菌藥物單藥的SI分別為＞32，＞32，16，16; MEM、CAZ、AMK、CIP與利血平聯合后SI分別為16、16、16、8；與奧美拉唑聯合后分別為16、32、16、8；與阿奇霉素聯合后分別為8、16、16、8

11、；與CCCP聯合后分別為8、8、16、8；與PaβN聯合后分別為8、16、16、8。MEM、CAZ、CIP分別與AMK聯合后的SI分別為4、4、8。阿米卡星與環(huán)丙沙星聯合后阿米卡星的SI為4。
　　 3動物實驗：
　　 3.1、單用環(huán)丙沙星組：1MIC、2MIC、4MIC、8MIC組家兔組織液中均有耐藥突變體的生長，隨濃度提高，菌落數逐漸減少，16MIC組沒有耐藥突變體生長。
　　 3.2、環(huán)丙沙星聯合妥布霉素組

12、：環(huán)丙沙星濃度為1MIC、2MIC組有耐藥突變體生長，4MIC、8MIC、16MIC組沒有耐藥突變體的生長。
　　 結論：
　　 體外體內試驗證實，兩種抗菌藥物聯合應用可以縮小細菌藥耐藥突變選擇窗，減少耐藥突變體產生的機會，從而有效控制細菌耐藥?？咕幬锱c外排抑制劑聯合可以縮小突變選擇窗，但作用弱于兩種抗菌藥物聯合，從而推測突變選擇窗內富集擴增的耐藥菌，在高于MIC濃度的抗菌藥物壓力下，主動外排系統(tǒng)只有少量激活，也沒有新