核轉錄因子PPARγ2誘導脂肪細胞分化及其分子機制研究.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學博士學位論文核轉錄因子PPARγ2誘導脂肪細胞分化及其分子機制研究姓名：左祥生申請學位級別：博士專業(yè)：內科學內分泌及代謝病指導教師：羅敏2001.3.1上海第二 醫(yī)科大學博士學 位論文供條 件 。 我 們 從 重 組 質 粒p c D N A 3 / m P P A R y 2 中 雙 酶 切F m P P A R y 2 基 因 序 列 ， 亞 克隆 入 逆轉 錄 病毒 載體p G C E N中 構 建 重 組 逆

2、轉 錄 病毒 載體p G C E N / m P P A R 刀。 用陽離 子 脂 質 體L i p o f e c t A M I N E 介導 重 組 逆轉 錄 病 毒 載 體p G C E N / m P P A R y 2 及p G C E N轉染包裝細胞系 P A 3 1 7 細胞，并用 G 4 1 8 進行抗性克隆篩選， 在 G 4 1 8 存在條件下穩(wěn)定傳3 - 4 代， 然后在無G 4 1 8 條件下生長4 8 h ，

3、細胞達 8 0 % 融合， 取其 1 = 清 1 : 1 0 0稀釋 后感染 N I H 3 T 3細胞， 并加 入 p o l y b r e n e 8 u g / m l ， 培 養(yǎng) 4 8 h后， 加 入 G 4 1 83 0 0 u g / m l o N I H 3 T 3細胞抗性克隆形 成后， 對抗性克隆進行計數， 計算病毒滴 度，病毒滴度=克隆數x 病毒液稀釋倍數。 待其抗性克隆生長融合成片， 胰酶消化， 在G 4

4、 1 8 存在條件下 穩(wěn) 定傳代3 - 4 代， 即 為p G C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3 細胞及p G C E N- N I H 3 T 3 細胞。 免 疫熒光染 色及免疫印 跡 方法來鑒定m P P A R y 2 基 因在N I H 3 T 3 細胞中 表 達 情 況。 取p G C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3 和p G C E N - N I

5、 H 3 T 3 細 胞 接種 于1 2孔 板中， 在 含1 0 % 胎牛 血 清 和S u g / m l 胰島 素的D M E M培 養(yǎng) 基中 生 長至1 0 0 融 合，再在上述培養(yǎng)液中加入 l u m的地塞米松培養(yǎng)4 8 h ， 最后在D M E M培養(yǎng)液 ( 含 1 0 %胎牛 血 清 和 5 u g / m l 胰島 素) 中 加入 1 0 0 p m的P P A R y 激活 物 E T Y A ， 繼續(xù) 培 養(yǎng) 1 0

6、天， 其間 每兩天換一次培養(yǎng)液。 用甲 醛鈣固 定細胞后，用油紅 O染色細胞內 脂質。以 經上 述同 樣 分 化 過 程的p G C E N - N I H 3 T 3 細胞 作 陰 性 對照 細胞。 同 時 用R T - P C R鑒定誘導 分化的 脂肪細 胞中 特異 性基因A P 2 和 L e p t i n 表 達情況。 結果 表明 我 們成功 構 建了 重 組 逆 轉 錄 病 毒 載 體 p G C E N / m P P A

7、 R y 2 0 通過 對 逆 轉 錄 表達 載 體 進 行 包裝， 獲 得了 含 較高 滴 度 重 組 逆 轉 錄 病 毒p G C E N / m P P A : E 2 y 2 及p G C E N病 毒 的 培 養(yǎng) 土清， 病毒滴度分別為5 x 1 0 ^ C F U / m l 和6 x 1 0 5 C F U / m l 。 用逆轉錄病毒上清感染N I H 3 T 3細 胞后， 免 疫 熒光 染色 可見， p G

8、C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3細胞 核呈 黃綠色 改 變，為m P P A R y 2 表 達陽 性 細 胞， 而p G C E N - N I H 3 T 3 細 胞 核 未 見 上 述 改 變。 進一 步 用油 紅O 及H E 染色， 發(fā) 現(xiàn)經上 述分 化1 0 天 后的p G C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3 細胞中 ，部 分細胞胞 漿含有 較多 被

9、染 成紅色的中 性脂肪， 細 胞形 態(tài)由 N I H 3 T 3 的 梭形變成圓 形 ，且細胞核移向 細胞一側， 與體內 成熟脂肪細胞形態(tài)相似，這些細胞被稱之為誘導分化的 脂肪細胞。 p G C E N - N I H 3 T 3細胞同 樣經上 述分 化過程， 未見 上述改 變， 被稱之為陰性對照細胞。R T - P C R 結果提示誘導分化的脂肪細胞不僅在細胞形態(tài)上發(fā)生上述特異性改變， 而且表達脂肪細胞特異性基因A P 2 和L e