同源框基因HOXA11啟動子重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達.pdf

1、同源框基因(homeobox gene)是一類調(diào)控胚胎發(fā)育和細胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，這類基因中都存在一個由183個堿基對(bp)組成的、高度保守的同源框(homeobox)序列。HOX基因是同源框基因中的一大類，其表達的蛋白質(zhì)是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，都有一個由相應同源框序列編碼的約61個氨基酸組成的同源域(1aomeodomain)結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)通過與順式調(diào)控元件相結(jié)合，實現(xiàn)．HOX基因?qū)Π谢虻恼{(diào)控。HOXA11屬HOX基因家族中的一員，

2、在胚胎尾部體節(jié)中表達，主要參與子宮形態(tài)的發(fā)生和發(fā)育；HOXA11基因的產(chǎn)物作為轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜形態(tài)發(fā)育和分化成熟。卵巢激素與HOX基因表達的關(guān)系成為近年來生殖領域的研究熱點。目前認為．HOX基因是性激素對子宮調(diào)節(jié)鏈中的重要介導基因，雌、孕激素對內(nèi)膜的多種調(diào)節(jié)作用主要通過HOX基因介導完成的。本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，HOXA11在子宮內(nèi)膜的表達受雌、孕激素調(diào)節(jié)，在分泌中期HOXA11表達變化最明顯；并且首次發(fā)現(xiàn)，分泌中期內(nèi)膜腺上皮

3、HOXA11的表達明顯減弱甚至消失、孕激素對內(nèi)膜腺上皮HOXA11基因的表達具有負調(diào)控作用。這種負調(diào)控作用與分泌中期內(nèi)膜的分化、成熟以及子宮接受態(tài)(receptive state)的形成密切相關(guān)。但是，有關(guān)孕激素對內(nèi)膜腺上皮HOXA11基因的負調(diào)控作用機制，目前尚不清楚；HOXA11基因的啟動子區(qū)是否存在著孕激素反應元件尚未見報道。因此，本研究的目的是：通過構(gòu)建HOXA11 pEGFP-啟動子重組質(zhì)粒，確定．HOXA11基因啟動子的位置

4、；證明．HOXA11啟動子區(qū)是否存在孕激素反應元件，為進一步研究孕激素對內(nèi)膜腺上皮負調(diào)控機制奠定實驗基礎。 主要方法： 從基因庫中查找人HOXA11基因序列，分別在正義鏈和反義鏈上預測兩段啟動子區(qū)域(分別命名為啟動子1，啟動子2)，設計PCR引物：從人蛻膜組織中提取基因組DNA，用PCR方法得到克隆目的基因片段： PCR產(chǎn)物TA克隆(包括連接、轉(zhuǎn)化、藍白斑篩選、質(zhì)粒DNA提取、鑒定和測序)；TA克隆產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后

5、與表達載體pEGFP-1定向克隆(包括連接、轉(zhuǎn)化、卡那霉素篩選、質(zhì)粒DNA提取、鑒定和測序)。重組后的pEGFP-1表達載體轉(zhuǎn)染至Ishikawa細胞，加孕酮處理，觀察加入孕酮前后細胞中綠色熒光蛋白的表達情況。結(jié)果： 1．經(jīng)測序TA克隆化和定向克隆化的目的基因序列與Gene bank中的序列比較，復合率達99﹪以上，故重組T質(zhì)粒和重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2．轉(zhuǎn)染pEGFP-啟動子1重組表達質(zhì)粒的Ishikawa細胞中可見

6、綠色熒光。 3．轉(zhuǎn)染pEGFP-啟動子1重組表達質(zhì)粒的Ishikawa細胞，經(jīng)孕酮處理后可見更強的綠色熒光。 4．轉(zhuǎn)染pEGFP-啟動子2重組質(zhì)粒的Ishikawa細胞，在孕酮處理前后均未檢測到綠色熒光。 5．啟動子1序列中查找到與孕激素反應元件相似的序列，位于HOXAll基因正義鏈1048-1062bp和1492-1506bp之間，與經(jīng)典序列比較符合率>50﹪。 結(jié)論： 本實驗用分子克隆技術(shù)成功

7、的構(gòu)建了HOXAll啟動子重組表達質(zhì)粒，同時采用細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染技術(shù)對重組表達質(zhì)粒做了功能鑒定，初步確定了HOXAll基因啟動子序列和孕激素反應元件的位置。結(jié)論如下： 1．HOXAll啟動子1重組表達質(zhì)粒(pEGFP-啟動子1)轉(zhuǎn)染至Ishikawa細胞后，可檢測到細胞內(nèi)綠色熒光。提示啟動子1具有啟動子功能，位于HOXAll基因正義鏈(AF039307)993-2016bp之間，全長1024bp。 2．HOXAll啟動子1

8、重組表達質(zhì)粒(pEGFP-啟動子1)轉(zhuǎn)染至Ishikawa細胞經(jīng)孕激素處理后，可檢測到更亮的綠色熒光。提示啟動子1區(qū)域含有孕激素反應元件。 3．HOXAll啟動子1序列中含有與孕激素反應元件相似的序列，位于HOXAll基因正義鏈的1048-1062bp和1492-1506bp之間。 4．HOXAll啟動子2(反義鏈的啟動子區(qū))重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Ishikawa細胞后，未檢測到綠色熒光；經(jīng)孕酮處理后，仍未檢測到綠色熒光。提