KiM-1小鼠模型的構建及其腎纖維化機理研究.pdf

1、研究背景：腎臟損傷因子-1(Kidney Injury Molecule1,Kim-1)是Ⅰ型跨膜糖蛋白,由甲肝病毒受體-1(HAVcr-1)基因編碼,其細胞外片段由一個粘液素功能區(qū)連接一個由六個半胱氨酸組成的球蛋白樣功能區(qū)構成。正常情況下,腎臟組織幾乎不表達Kim-1蛋白,但是在腎臟損傷后數小時內Kim-1的表達水平即顯著升高。通過原位雜交和免疫組化分析發(fā)現Kim-1主要表達于損傷后再生的去分化近端腎小管上皮細胞,尤其在近端小管S3段

2、豐富的外髓質區(qū)域。研究證實腎小管細胞損傷后,Kim-1蛋白的胞外片段在活化的MAP激酶作用下脫落到尿液中排出體外,通過檢測尿液中Kim-1水平能夠早期靈敏診斷急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)。近10余年來的臨床前期及臨床實驗證實尿液Kim-1水平是AKI早期診斷及預后評估的靈敏指標。與多數傳統(tǒng)使用的生物學指標相比較(血肌酐,血尿素氮等),Kim-1具有更高的靈敏度和特異性,其表達水平能夠反映腎臟的實際病理損傷

3、程度(具體可參考綜述一)。目前,急性腎損傷網絡(Acute Kidney Injury Network,AKIN)已經將尿液Kim-1列為AKI的領先診斷指標之一。
　　近年來腎臟病學者發(fā)現Kim-1在腎小管損傷過程中不僅僅只是一個“結果表現”,同時也是腎臟病理損傷及修復過程的“參與者”。美國哈佛大學醫(yī)學院Bonventre實驗室發(fā)現在大鼠AKI發(fā)生后Kim-1能夠促使腎小管上皮細胞向“半專業(yè)”吞噬細胞轉化,從而發(fā)揮清除凋亡細胞和

4、壞死組織碎片的作用。對AKI的病理生理機制研究已經證實,壞死組織碎片的清除有利于腎小管上皮細胞的再生及小管重構,是AKI后炎癥反應的重要環(huán)節(jié),因此,Kim-1在AKI損傷一修復過程中具有重要的保護作用。然而,對慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)的研究發(fā)現,尿液Kim-1水平與部分CKD的發(fā)病及預后具有很高相關性,在Kim-1表達明顯的區(qū)域,腎小管損傷、炎癥反應及纖維化程度嚴重,提示Kim-1可能參與調控C

5、KD的發(fā)生發(fā)展。以上研究結果提示Kim-1在AKI及CKD的疾病過程中發(fā)揮不同的生物學作用,可能是調控急、慢性腎臟損傷轉歸的重要樞紐因子,但其具體分子機制仍不清楚。因此,深入探討Kim-1在腎組織中的病理生理功能,將有助于更好了解CKD及腎臟纖維化的發(fā)病機制,并可能發(fā)現早期干預治療的靶點。
　　由于Kim-1在正常腎臟組織中幾乎不表達,目前仍缺乏有效研究Kim-1體內功能的動物模型。為此,本課題將通過構建腎小管上皮細胞條件性表達K

6、im-1蛋白的轉基因小鼠模型,探討Kim-1慢性表達對小鼠腎組織的影響及其相關分子機制。課題主要包括三部分:
　　1.Kim-1小鼠模型的構建及表型鑒定;
　　2.腎小管上皮細胞條件性表達Kim-1致腎臟炎癥損傷及纖維化的機制研究;
　　3.mTOR信號通路介導Kim-1REC-tg小鼠腎間質纖維化的機制研究。
　　第一章:Kim-1小鼠模型的構建及其表型鑒定
　　目的：構建腎小管上皮細胞條件性表達Kim-

7、1蛋白的轉基因小鼠,探討Kim-1慢性表達對小鼠腎臟的影響。
　　方法：通過Cre/Loxp位點重組酶原理構建轉基因小鼠,首先體外構建依賴Cre重組酶活性表達的Kim-1及堿性磷酸酶(AP)線性基因片段(Z/Kim-AP)。顯微注射方法將Z/Kim-AP基因片段導入FVB小鼠受精卵前核,將轉基因后的受精卵植入假孕FVB雌鼠體內,三周后獲得Z/Kim-AP轉基因小鼠。Z/Kim-AP小鼠與Six2-GFPCre小鼠(Six2為啟動子

8、)雜交后獲得皮質及外髓腎小管上皮細胞特異性表達Kim-1蛋白的雙基因雜交鼠(Kim-1REC-tg)。PCR及免疫組化方法進行小鼠基因型鑒定。按PCR結果,篩選Kim-1陽性表達的Kim-1REC-tg小鼠,同窩Kim-1陰性小鼠作為對照組。根據實驗設計,檢測不同周齡小鼠的血肌酐(Scr)、電解質、紅細胞比容(Hct)、尿蛋白、尿NAG、尿Kim-1及各項生理指標(血壓、體重、生存率)情況,小鼠腎組織行電鏡及免疫組化分析。
　　結

9、果：PCR基因型鑒定結果表明Kim-1REC-tg小鼠的出生率符合孟德爾比例,Kim-1REC-tg小鼠出生后腎臟組織即表達Kim-1 mRNA及蛋白。新生Kim-1REC-tg小鼠腎臟重量及腎單位總數較對照組分別少23％和46％,但腎小球平均直徑未見明顯差異。新生小鼠腎臟病理學檢查較對照組未見顯著差異。兩周齡Kim-1REC-tg小鼠病理學檢查示局部小管空泡變性及上皮細胞退行性變,余腎小球、腎間質及腎血管未見明顯異常。4周齡小鼠腎臟出

10、現明顯病理損傷,部分腎小管空泡變性,管腔擴張及蛋白管型形成,腎間質局部單個核細胞浸潤,少量腎小球局灶性硬化。12周齡Kim-1REC-tg小鼠腎臟出現廣泛炎性細胞浸潤,腎小管細胞壞死脫落,大量蛋白及細胞管型形成,腎間質顯著纖維化,彌漫性腎小球球性硬化。Kim-1REC-tg小鼠血肌酐水平在6-10周始較對照組顯著升高,并進行性加重,多數Kim-1REC-tg小鼠在11周(中值)左右因自發(fā)性腎功能衰竭死亡。尿蛋白檢測提示Kim-1REC-

11、tg小鼠自4周始出現進行性加重的蛋白尿。Kim-1REC-tg小鼠同時合并慢性腎功能衰竭的并發(fā)癥,包括貧血,低蛋白血癥,高血壓及水電解質紊亂。
　　結論：
　　1.成功構建首個腎小管上皮細胞條件性過表達Kim-1蛋白的轉基因小鼠;
　　2.Kim-1REC-tg小鼠合并慢性腎功能衰竭的多種并發(fā)癥,具有CKD進行性發(fā)展的典型疾病表型;
　　3.腎小管上皮細胞條件性表達Kim-1誘導腎臟炎癥損傷及纖維化,提示Kim-

12、1是抗腎臟纖維化治療的潛在靶點。
　　第二章Kim-1慢性表達致腎臟炎癥損傷及纖維化機制研究
　　目的：探討Kim-1慢性表達致腎臟進行性炎癥損傷及纖維化的細胞學及分子生物學機制。
　　方法：免疫熒光染色評估不同年齡組小鼠F4/80陽性細胞的數目及分布情況。取不同年齡組Kim-1REC-tg小鼠腎皮質組織提取mRNA,采用實時熒光定量PCR(realtime-PCR)分析各組間生長因子(PDGF-b等)及炎癥因子(TN

13、F-α等)表達水平的差異。取4周齡Kim-1REC-tg小鼠,原代培養(yǎng)純化分離后的腎小管上皮細胞,4-5天后收集細胞培養(yǎng)液,ELISA法檢測TNF-α的表達水平。構建腎缺血再灌注損傷(IRI)小鼠模型,取損傷后72小時腎臟組織免疫組化共染色,分析Ki67陽性細胞與Kim-1表達的分布關系。Kim-1REC-tg小鼠腎臟組織免疫組化染色,計數不同年齡組小鼠腎皮質區(qū)Ki67陽性的小管上皮細胞及腎小球細胞數,計數間質內CD3+細胞數。

14、　　結果：免疫熒光共染色結果顯示,4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎間質大量F4/80陽性細胞浸潤,且多圍繞Kim-1陽性腎小管,10周齡Kim-1REC-tg小鼠上述表現更顯著。CD3+T細胞免疫組化染色及陽性細胞計數結果示,4周后的Kim-1REC-tg小鼠腎小管周一腎間質出現明顯CD3+細胞浸潤,12周后CD3+T細胞數顯著增加,部分CD3+細胞遷移進入小管腔,上述結果提示Kim-1對炎癥細胞具有顯著趨化作用。Realtime-P

15、CR結果示2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質即出現炎癥反應(IL-6、CXCL-1和MCP-1表達增高),4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質炎癥級聯反應加重,多種炎癥因子表達水平顯著上調,10周齡小鼠腎皮質多種炎癥因子水平升高數十至數百倍,提示Kim-1誘導Kim-1REC-tg小鼠腎組織進行性加重的炎癥反應。4周齡Kim-1REC-tg小鼠原代腎小管上皮細胞的培養(yǎng)液中TNF-α水平較對照組顯著升高,進一步支持表達Kim-1的腎

16、小管上皮細胞分泌炎癥因子促發(fā)腎臟炎癥級聯反應。腎缺血再灌注損傷72小時小鼠腎組織免疫組化共染色結果示Kim-1陽性腎小管上皮細胞同時表達Ki67,提示AKI后Kim-1陽性腎小管上皮細胞增生活躍。免疫組化結果示部分2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎臟囊腫形成,囊腔上皮細胞共表達Kim-1及Ki67;4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質區(qū)Kim-1陽性腎小管同時高度表達Ki67,提示Kim-1REC-tg小鼠Kim-1陽性上皮細胞增生活

17、躍。統(tǒng)計學分析結果示2周齡、4周齡、12周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質區(qū)Ki67陽性腎小管上皮細胞數均較對照組顯著增加;4周齡Kim-1REC-tg小鼠Ki67陽性腎小球細胞數較對照組顯著增加。Realtime-PCR分析結果示2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質PDGF-b及TGF-β表達水平即出現升高,4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質EGF、FGF、PDGF-b、CTGF及TGF-β的表達均顯著高于對照組,以上結果提示

18、Kim-1表達刺激腎皮質細胞大量合成多種生長因子,導致腎組織細胞增生活躍,腎單位結構功能異常。
　　結論：
　　1、表達Kim-1的腎小管上皮細胞持續(xù)分泌TNF-α等前炎癥因子,誘導炎癥細胞遷徙浸潤,導致進行性加重的腎臟炎癥損傷;
　　2、Kim-1介導腎小管上皮細胞合成多種生長因子,導致腎組織細胞異常增生,腎單位結構和功能異常;
　　3、Kim-1慢性表達誘導Kim-1REC-tg小鼠腎間質持續(xù)炎癥損傷及進行性

19、纖維化,提示Kim-1是腎纖維化的潛在治療靶點。
　　第三部分mTOR信號通路介導Kim-1REC-tg小鼠腎間質纖維化的機制研究
　　目的：研究mTOR信號通路在Kim-1慢性表達致Kim-1REC-tg小鼠腎間質纖維化過程中的調控作用。
　　方法：realtime-PCR及免疫組化方法分析2-5周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質組織mTOR信號通路中各效應因子的表達情況。4周齡Kim-1REC-tg小鼠隨機分為治

20、療組(n=6)及安慰劑組(n=6),同窩Kim-1陰性小鼠作為空白對照組(n=5),治療組小鼠腹腔注射雷帕霉素(2mg/kg/day),安慰劑組腹腔注射等量生理鹽水。6周后分別檢測兩組小鼠尿蛋白及血肌酐水平,腎臟組織病理切片評估腎臟損傷程度,western-blot檢測pS6K及αSMA表達水平,realtime PCR檢測腎組織炎癥因子表達水平,腎組織免疫組化染色分析腎皮質pS6K表達特點及F4/80陽性細胞、αSMA陽性細胞浸潤情況

21、,分別計數各組小鼠腎組織中Ki67陽性細胞及CD3陽性細胞。
　　結果：realtime-PCR結果顯示2周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質組織AKT、mTOR及e1F4E-BP3的mRNA表達較同窩對照組顯著增高,4周齡Kim-1REC-tg小鼠腎皮質組織中mTOR通路多個效應因子水平均明顯增高。免疫組化分析示4周齡Kim-1REC-tg小鼠大量腎小管上皮細胞及腎間質細胞表達pS6K,提示Kim-1REC-tg小鼠腎組織mTO

22、R通路顯著激活。雷帕霉素治療6周后,Kim-1REC-tg小鼠尿蛋白及血肌酐水平較對照組明顯降低,腎臟病理學檢查示治療組小鼠腎小管損傷較對照組明顯減輕。Western blot及免疫組化分析示與對照組相比,治療組小鼠腎組織pS6K及αSMA的表達水平顯著下調,腎間質F4/80陽性細胞數顯著減少,腎間質纖維化程度明顯減輕,Ki67陽性細胞及CD3+細胞數均較對照組明顯減少,雷帕霉素顯著減輕Kim-1REC-tg小鼠腎臟炎癥損傷及纖維化程度