缺氧對骨髓間充質干細胞骨向分化調控的體外研究.pdf

1、以成骨細胞為中心的骨改建是正畸牙移動的生物學基礎，骨對機械力的反應是通過什么機制進行的目前并沒有完全明了。但有一點是肯定的，在正畸力作用下由于壓力側受壓導致血供減少，形成了缺氧的微環(huán)境。有學者推測，氧分壓的改變可能是骨改建中潛在的扳機點“trigger”?，F已證實間充質干細胞(MSCs)是成骨細胞的日仃體細胞，體外經誘導可向成骨細胞分化。關于缺氧對骨髓間充質干細胞骨向分化的影響及調控機理目前尚不清楚。 本研究擬通過體外分離、純化

2、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，建立骨髓間充質干細胞骨向誘導分化細胞模型，采用Jouan三氣缺氧培養(yǎng)體系；運用熒光標記技術、酶比活力定量檢測、實時熒光定量PCR及Westernblotting蛋白免疫印跡等先進技術方法，研究不同作用時間的缺氧對骨髓間充質干細胞骨向分化中體現成骨功能效應的堿性磷酸酶(ALP)比活性、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(0C)基因及骨特異性轉錄調控因子(Cbfal)基因和蛋白表達的影響；并對其絲裂原活化蛋白激酶(MAP

3、Ks)信號通路中的ERK和P38通路的調控機制進行初步探索。從細胞和分子生物學水平上深入系統(tǒng)地探討機械力介導的微環(huán)境缺氧對骨髓間充質干細胞骨向分化的調控，從而為進一步闡明正畸牙移動骨改建機理奠定實驗基礎。 結果顯示： 1．通過密度梯度離心法成功分離培養(yǎng)了rMSCs，結合貼壁法獲得了較高純度的3～5代rMSCs，并經骨向誘導可成功培養(yǎng)出具有成骨細胞表型的rBMSCs。 2．缺氧對rBMSCs骨向誘導分化中ALPas

4、e、比活性ALPase及OC mRNA的表達在作用的前12h均有一過性的升高作用，但無統(tǒng)計學意義；隨作用時間的延長，有較明顯的抑制作用，其中mRNA表達在72h和96h抑制效應最強，具有時效性。 3．Cbfal／OSF2 mRNA的表達在缺氧48h后非常下降顯著，幾乎不表達，72h和96t1分別下調了90％和89％；而其蛋白水平雖不如基因改變明顯，但仍呈下降趨勢，在96h也下調了63％。 4．缺氧培養(yǎng)下5min ER

5、Kl／2 MAPK信號通路被迅速激活，磷酸化程度升至Omin對照組的231％； 15min時有所回落，但仍維持較高激活水平；隨后在45min時迅速下降，與135min和6h時一樣維持在一基線水平。而P38 NAPK信號通路蛋白磷酸化水平無明顯變化，維持在一基線水平，各時間點之間沒有統(tǒng)汁學差別。 結論及提示： 1．rMSCs骨向誘導可成功模擬整個成骨細胞分化過程，為后續(xù)研究提供細胞學模型。 2．2％缺氧通過下調成

6、骨功能蛋白ALPase酶活性、ALPase及OC基因表達對大鼠骨髓間充質干細胞骨向誘導分化成骨效應有抑制作用。 3．2％缺氧對大鼠骨髓間充質干細胞骨向誘導分化中作為成骨細胞特異性轉錄因子的核心結合因子Cbfal基因和蛋白表達的均有顯著抑制作用。 4．ERKl／2 MAPK信號通路參與了缺氧抑制rBMSCs骨向誘導分化的調控過程：而P38 MAPK信號通路沒有被激活，可能不參與調控。 缺氧很有可能就是通過抑制成骨

7、細胞特異性轉錄因子cbfal這一關鍵節(jié)點下調ALPase及OC等這些代表成骨細胞功能狀態(tài)的酶和細胞外基質蛋白的表達對大鼠骨髓間充質干細胞骨向分化起抑制調控作用；而細胞對外界缺氧的應激很有可能是通過激活了ERKl／2 MAPK信號通路的級聯反應介導Cbf α 1活性和表達發(fā)揮調控作用，由于間充質干細胞向成骨細胞分化信號轉導問題的網絡性和復雜性，尚不能說明其唯一性和重要性，但至少肯定參與了此調控過程。 推測可能調控機制:缺氧應激→