CAT-1作為一種新的細胞粘附分子介導了內皮完整性和L-arginine轉運.pdf

1、心腦血管疾病如冠心病、高血壓、腦卒中、肺動脈高壓等是人類健康的主要殺手。尋找其有效的干預措施，是關系國計民生的迫切需求。該組疾病病因復雜，大多由遺傳及環(huán)境等多因素所致，但內皮完整性受損和內皮細胞功能障礙是該組疾病發(fā)生的早期關鍵環(huán)節(jié)。
　　內皮細胞連接是內皮完整性的分子基礎，在調節(jié)血管功能方面發(fā)揮了重要的作用。在多細胞生物中，細胞連接對于許多生物功能是必需的，如形態(tài)發(fā)生、細胞分化、增殖、凋亡和遷移。超微結構研究發(fā)現(xiàn)，內皮細胞有三種類

2、型細胞連接，即間隙連接(GJs)、緊密連接(TJs)和粘附連接(AJs)。相鄰細胞之間的GJs可以形成跨膜通道，而TJs和AJs則通過跨膜同嗜性粘附作用沿細胞邊緣形成細胞外拉鏈結構。在三種內皮細胞連接中，AJs是其主要類型，鈣粘蛋白(cadherins)和連接素(nectins)是已知的AJs之一。然而，針對這些已知分子的干預措施并不能完全阻斷上述病理狀態(tài)下的內皮通透性增加及完整性受損。
　　CAT-1分子家族的第一個成員（小鼠C

3、AT-1，mCAT-1）最初被鑒定為莫洛尼鼠白血病病毒受體(MuLVR)。氨基酸序列同源比較及氨基酸轉運功能實驗揭示CAT-1亦是一種鈉離子依賴的陽離子氨基酸轉運蛋白從而介導了陽離子氨基酸如L-arginine(L-Arg)的跨膜轉運。L-Arg是細胞NO合成的唯一前體物質，在內皮細胞中CAT-1作為L-Arg的主要跨膜轉運蛋白，通過介導胞外L-Arg的跨細胞膜轉運從而增加內皮細胞NO產生濃度。NO是一多功能生物活性分子，它通過調節(jié)血管

4、平滑肌張力、抑制白細胞及血小板與血管內皮粘附、抑制血管平滑肌細胞的增生及向內膜遷移，在維持血管生理功能中發(fā)揮重要作用。另外，NO通過調節(jié)多種血管介質影響血管內皮通透性調節(jié)，過量表達NO后會增加內皮通透性。
　　最近研究顯示，CAT-1在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要作用，比如其過表達可以緩解氧化應激性內皮病理過程和肥胖導致的高血壓等。但是，CAT-1對于血管內皮完整性的研究尚未有文獻報道。鑒于過表達CAT-1可以增加內皮細胞NO的生成

5、，而過量產生的NO又會增加內皮細胞通透性，因此我們猜想CAT-1過表達會增加內皮細胞通透性、損傷內皮完整性。但是，根據(jù)我們的預實驗結果，CAT-1過表達增加了NO的生成，但是并沒有增加內皮細胞通透性，相反，降低CAT-1表達后反而增加內皮通透性。因此，內皮細胞CAT-1可能通過一種不依賴于NO的其他機制參與了內皮穩(wěn)定性調節(jié)，比如穩(wěn)定內皮細胞連接等。因此，本課題旨在通過構建CAT-1/GFP融合蛋白，研究CAT-1通過何種機制維持了內皮通

6、透性。
　　目的:
　　1、構建CAT-1/GFP融合表達蛋白，并評價該融合蛋白是否具有野生型CAT-1相一致的生物學功能;
　　2、分析CAT-1是否通過穩(wěn)定內皮細胞連接維持了內皮的完整性;
　　3、驗證CAT-1是否具有細胞粘附分子的生化特點及功能特征;
　　4、探討CAT-1轉運底物L-Arg對其發(fā)揮氨基酸轉運和細胞連接功能的影響。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.利用PCR方法

7、從內皮細胞克隆獲取CAT-1基因序列，將基因片段亞克隆至pENTR1 A/GFP穿梭質粒形成CAT-1/GFP融合基因穿梭載體，然后采用Gateway LR重組技術構建獲得腺病毒載體pAd-CAT-1/GFP和慢病毒載體pLenti-CAT-1/GFP，分別轉染293A細胞和293FT細胞生產病毒，最后感染PAEC細胞和CHO-S細胞建立過表達CAT-1的細胞模型;
　　2.CAT-1/GFP腺病毒感染豬肺動脈內皮細胞(PAEC)

8、，采用同位素方法檢測L-Arg轉運和NO生成，評價CAT-1/GFP融合蛋白是否具有野生型CAT-1一致的生物學功能;
　　3.活細胞共聚焦顯微鏡觀察CAT-1在PAEC細胞的表達及亞細胞定位;
　　4.Western blot用以檢測CAT-1/GFP的單體-二聚體(mono-dimer)形式;蛋白交聯(lián)劑BS3處理CHO-S懸浮細胞，并通過Western blot檢測CAT-1二聚體形式是反式（trans）還是順式（cis

9、）結合;
　　5.建立穩(wěn)定表達CAT-1/GFP融合蛋白的CHO-S細胞系，采用細胞凝集反應檢測CAT-1是否具有促進細胞同源粘附的功能;
　　第二部分:
　　1.利用伊文氏藍-白蛋白(EB-albumin)作為示蹤劑，單層內皮細胞通透性實驗用以分析CAT-1對內皮細胞通透性的影響;
　　2.活體細胞共聚焦顯微鏡分析L-Arg處理對CAT-1介導的內皮細胞連接及其亞細胞定位的影響。
　　結果:
　　第

10、一部分:
　　1、酶切鑒定及序列測序分析證實CAT-1克隆序列以及CAT-1/GFP融合表達基因正確無誤，并且成功包裝了腺病毒和慢病毒;
　　2、CAT-1/GFP融合蛋白具有與CAT-1一致的生物學功能
　　成功提取并培養(yǎng)了PAEC細胞，經形態(tài)學觀察及第八因子抗原染色（Ⅷ-R Ag），細胞純度大于95％; PAEC細胞過表達CAT-1/GFP后，與表達GFP對照細胞比較，其L-Arg轉運能力增加了9倍(P＜0.01)

11、，NO生成水平升高了5倍(P＜0.01)，說明重組的CAT-1/GFP融合蛋白具有與野生型CAT-1一致的功能;
　　3、CAT-1蛋白主要定位在內皮細胞-細胞連接部位
　　PAEC細胞表達CAT-1/GFP，利用共聚焦顯微鏡通過綠色熒光可以發(fā)現(xiàn)CAT-1/GFP主要定位在細胞-細胞連接部位，細胞核周圍的熒光表示新生成的蛋白;CAT-1/GFP表達水平在48-72h達到高峰，可以維持至少7d;同時，免疫細胞熒光染色證實野生型

12、CAT-1也有細胞-細胞連接部位的定位。提示CAT-1可能是一種細胞粘附分子。
　　4、CAT-1蛋白具有反式同源二聚體的特點
　　采用4-20％ SDS-PAGE梯度分離膠分析蛋白樣品，可見CAT-1/GFP有兩種形式存在，一種是大小為190KD的二聚體形式，另一種是大小為95KD的單聚體形式，說明CAT-1/GFP可以發(fā)生同源二聚;而利用BS3蛋白交聯(lián)劑處理單個懸浮CHO-S細胞，CAT-1/GFP蛋白條帶是單一條帶(9

13、5KD)，表明CAT-1/GFP的同源二聚體形式是反式結合。說明CAT-1具有細胞粘附分子的生化特征。
　　5、CAT-1蛋白具有促進懸浮CHO-S細胞同源粘附的功能
　　用CAT-1/GFP及GFP對照慢病毒分別感染CHO-S細胞，blastidin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株，細胞凝集反應實驗顯示CAT-1/GFP表達細胞株比GFP表達細胞株更容易發(fā)生凝集現(xiàn)象（P＜0.05）。除此之外，CAT家族其他幾個成員，比如CAT

14、-2b、CAT-3和CAT-4也具有促進細胞凝集反應的特點，而CAT-4不具有氨基酸轉運功能，說明CATs家族促進細胞同源粘附與其氨基酸轉運能力無關。進一步證實CAT-1是一種細胞粘附分子。
　　第二部分:
　　1.降低內皮細胞CAT-1表達水平增加內皮通透性
　　利用小干擾RNA降低內皮細胞CAT-1表達后，EB-albumin通透率升高26±6％，與對照組細胞比較，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而過表達CAT-1/

15、GFP后，EB-albumin通透率降低趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義，可能機制是內皮細胞基底水平的CAT-1或其它粘附分子足以維持內皮細胞完整性;
　　2.L-Arg處理會降低CAT-1內置、抑制內皮細胞CAT-1介導的細胞連接分離
　　給予內皮細胞1mM劑量的L-Arg處理后，與對照組細胞比較，CAT-1/GFP組細胞CAT-1內置降低，細胞-細胞連接分離明顯減慢，L-Arg轉運能力明顯增加(P＜0.01)，并且同時有CAT-

16、1的膜轉位現(xiàn)象發(fā)生。這些實驗結果說明L-Arg具有穩(wěn)定內皮細胞連接的功能，同時也為解釋氨基酸悖論（L-Arg paradox）和反式刺激（trans-stimulation）現(xiàn)象提供了新的依據(jù)。
　　結論:
　　1.融合蛋白CAT-1/GFP具有與野生型CAT-1一致的生物學功能，因此可利用抗GFP抗體和綠色細胞熒光研究CAT-1蛋白的亞細胞定位和功能;
　　2.CAT-1是一種新的細胞粘附分子，通過穩(wěn)定內皮細胞-細胞