孕酮對(duì)Aβ25-35損傷的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種常見(jiàn)的退行性疾病。其中β-淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)沉積被公認(rèn)為AD的核心發(fā)病機(jī)制，Aβ在腦內(nèi)大量沉積可引起腦組織局部炎癥等一系列反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致突觸減少，神經(jīng)元凋亡最終引其起AD。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類(lèi)具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，在一定條件下NSCs可以被誘導(dǎo)分化、增殖并遷移，

2、修復(fù)各種病理引起的神經(jīng)細(xì)胞缺失等病變。然而在AD患者腦內(nèi)存在的神經(jīng)干細(xì)胞的存活率和分化率較低，表現(xiàn)為神經(jīng)元漸進(jìn)性、持續(xù)性的丟失，提示神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化受到抑制，不能補(bǔ)充大腦丟失的神經(jīng)元。
　　局部環(huán)境決定了神經(jīng)干細(xì)胞的最終命運(yùn)，神經(jīng)甾體水平是調(diào)節(jié)局部微環(huán)境的重要因素。作為神經(jīng)甾體之一的孕酮主要通過(guò)抑制中樞興奮性、抗炎癥、抗細(xì)胞調(diào)亡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等作用而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損害具有保護(hù)作用。因此研究抑制AD患者腦內(nèi)Aβ?lián)p傷，藥物誘導(dǎo)內(nèi)源性NS

3、Cs分化，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，可為AD的治療提供新的途經(jīng)和方法。本研究以新生大鼠海馬區(qū)分離出的神經(jīng)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用Aβ的毒性片段Aβ25-35處理神經(jīng)干細(xì)胞，研究孕酮對(duì)Aβ25-35作用的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響及其機(jī)制。
　　方法:
　　1、神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及傳代
　　將剛出生的SD大鼠，無(wú)菌條件下分離兩側(cè)海馬。用0.125％胰蛋白酶/EDTA(1∶1)消化，加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終

4、止消化，吹打離心后，加入無(wú)血清完全培養(yǎng)液(DMEM/F12、B272％、EGF20ng/ml、bFGF20ng/ml)用吸管吹打制成細(xì)胞懸液，記數(shù)后接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，密度為5×105/ml。37℃，5％CO2條件下靜置培養(yǎng)6d，每2d半量換液1次。待長(zhǎng)成神經(jīng)干細(xì)胞球后，使用Acctuase酶進(jìn)行消化傳代。
　　2、神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
　　取傳代培養(yǎng)的NSCs，將其吹打成單細(xì)胞后，以1×106/孔的細(xì)胞密度種于6孔

5、培養(yǎng)板中（預(yù)先置有多聚賴(lài)氨酸涂布的蓋玻片），使用去bFGF和EGF含10％胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液作為分化培養(yǎng)基，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行血清誘導(dǎo)分化6天，37℃，5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞每2d半量換液1次。
　　3、凝聚態(tài)Aβ25-35的制備
　　將2mg Aβ25-35凍干粉溶解于1000ul無(wú)菌雙蒸水配制成2mmol/L的儲(chǔ)備液，混勻、分裝、-20℃凍存。臨用前37℃放置2～7天，使其老化、凝聚。
　　4、實(shí)驗(yàn)分組與給藥
　

6、　4.1 Aβ25-35和Aβ25-35+孕酮對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　取神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為Control、Aβ25-35（0.5μM、1.5μM、5μM、15μM、50μM）行MTT細(xì)胞活性檢測(cè)。分Control、Aβ25-35(0.5μM)、Aβ25-35加不同濃度PROG處理組（1μM、10μM、100μM、500μMPROG，各組同時(shí)加入0.5μMAβ25-35）行MTT細(xì)胞活性檢測(cè)。
　　4.2 Aβ25-35和

7、Aβ25-35+孕酮對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響
　　取誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為Control、Aβ25-35（0.5M）、Aβ25-35+PROG(10μM)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Real-time PCR檢測(cè)培養(yǎng)物β微管蛋白Ⅲ(βⅢ-Tubulin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及其mRNA的變化。
　　4.3孕酮使Aβ25-35作用下神經(jīng)干細(xì)胞分化增加的機(jī)制研究
　　取誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為Control、Aβ

8、25-35、Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+RU-486（孕酮核受體拮抗劑米非司酮）、Aβ25-35+PROG+AG-205（孕酮膜受體拮抗劑）行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)βⅢ-Tubulin、GFAP的變化。
　　取誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞隨機(jī)分為Control、Aβ25-35、 Aβ25-35+PROG、Aβ25-35+PROG+AG-490(JAK2/STAT3通路抑制劑)行Western blot檢測(cè)t-JAK2、t-

9、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白水平變化。其中Aβ25-350.5μM;PROG、RU-486、AG-205、AG-490均為10μM。
　　5、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率
　　收集分組加藥處理后的神經(jīng)干細(xì)胞離心，放入24孔板中，每孔加入40μLMTT(5mg·mL-1)，于37℃孵育4h，棄去培養(yǎng)基，每孔各加入300M1DMSO，混合均勻，酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞490nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD值），以各組細(xì)胞吸光度與對(duì)照

10、組吸光度的比值表示相對(duì)細(xì)胞存活率。
　　6、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定NSCs及其子代細(xì)胞
　　將懸浮培養(yǎng)NSCs接種于6孔培養(yǎng)板中（預(yù)先置有多聚賴(lài)氨酸涂布的蓋玻片），貼壁生長(zhǎng)4h;4％多聚甲醛固定;一抗Nestin巢蛋白(1∶1000)4℃過(guò)夜;二抗37℃避光孵育1h;熒光顯微鏡下觀察、攝片。
　　將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞爬片取出，孵育一抗βⅢ-Tubulin、GFAP4℃過(guò)夜;山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗孵育1h，其余方法同上，

11、行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。
　　7、Real-time PCR檢測(cè)βⅢ-Tubulin、GFAP的mRNA的表達(dá)
　　收集分組加藥處理后誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增成DNA后將反應(yīng)管置于Real-time檢測(cè)儀反應(yīng)。根據(jù)熒光定量分析儀輸出目的基因和參比基因的Ct值，基因表達(dá)量采用實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組=2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。
　　8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)βⅢ-Tubulin、GFAP的表達(dá)
　　收集分組加藥處

12、理后誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，加入培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，加入固定液、打孔液。βⅢ-Tubulin采用間標(biāo)法，加入βⅢ-Tubulin單克隆抗體，加入PE標(biāo)記的二抗，避光30min上機(jī)檢測(cè)。GFAP采用直標(biāo)法，加入PE標(biāo)記的GFAP單克隆抗體，避光30min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。
　　9、Western Blot檢測(cè)t-JAK2、t-STAT3、p-JAK2、p-STAT3表達(dá)
　　收集分組加藥處理后誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白備用

13、。煮沸變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，100mA濕轉(zhuǎn)法，脫脂奶粉封閉，分別加一抗t-JAK2、t-STAT3、p-JAK2、p-STAT3(1∶1000)孵育過(guò)夜，漂洗后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，ECL光化學(xué)法顯色，暗室中壓X光片顯影。結(jié)果經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描，測(cè)定各條帶積分光密度，以目的蛋白與β-actin積分光密度值的比值表示。
　　10、數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
　　以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

14、差（mean±SD）表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析（one way ANOVA）繼以Dunnettt test對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　由新生大鼠海馬分離的原代細(xì)胞，在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1d后大部分細(xì)胞死亡，小部分細(xì)胞聚集形成2～4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)。到7d時(shí)生長(zhǎng)成為數(shù)十個(gè)細(xì)胞到數(shù)百個(gè)細(xì)胞的集落，這些集落均成懸浮

15、球形生長(zhǎng)，邊界清楚，折光性強(qiáng)。Nestin巢蛋白免疫熒光染色顯示NSCs球呈紅色熒光。
　　2、神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與鑒定
　　使用去bFGF和EGF含10％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)NSCs進(jìn)行血清誘導(dǎo)分化，分化培養(yǎng)12h，即見(jiàn)有較多細(xì)胞從單細(xì)胞球周邊爬出。繼續(xù)培養(yǎng)6天分化成胞體較小，多數(shù)有1～2個(gè)突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞和突起粗大的多極膠質(zhì)樣細(xì)胞。免疫熒光染色顯示:神經(jīng)干細(xì)胞能分化成表達(dá)各種相應(yīng)特異性標(biāo)志的終末細(xì)胞:表達(dá)βⅢ-Tub

16、ulin的神經(jīng)元和表達(dá)GFAP的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3、Aβ25-35和Aβ25-35+孕酮作用對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　MTT結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，Aβ25-35濃度依賴(lài)的降低細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞增殖;0.5μM Aβ25-35能夠明顯減少神經(jīng)干細(xì)胞球的形成，細(xì)胞存活率比對(duì)照組的下降32.5％(P＜0.05)。加入Aβ25-35和不同濃度孕酮以后，與損傷組相比，孕酮能濃度依賴(lài)的降低Aβ25-35作用下的細(xì)胞存活率:10

17、μM孕酮使細(xì)胞存活率下降15％(P＜0.05)。
　　4、Aβ25-35和Aβ25-35+孕酮作用對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響
　　免疫熒光結(jié)果提示:與對(duì)照組相比，Aβ25-35組分化為神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例顯著減少(P＜0.05);與Aβ25-35組比較，孕酮保護(hù)組分化為神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例顯著增多(P＜0.05)。
　　Real-time PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，Aβ25-35組βⅢ-Tubulin和GF

18、AP mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別下降50％、70％(P＜0.01);與Aβ25-35損傷組相比，孕酮保護(hù)組βⅢ-Tubulin和GFAP mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.001)。
　　5、孕酮使Aβ25-35作用下神經(jīng)干細(xì)胞分化增加的機(jī)制研究
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，Aβ25-35損傷組分化成βⅢ-Tubulin、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率顯著降低(P＜0.01)。與Aβ25-35組比較，孕酮保護(hù)組分化成β

19、Ⅲ-Tubulin、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率顯著增高(P＜0.01)，與免疫熒光、Real-time PCR結(jié)果一致。與Aβ25-35+孕酮組比較，AG-205處理組分化成βⅢ-Tubulin、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率顯著降低(P＜0.001);RU-486處理組分化成βⅢ-Tubulin、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＞0.05)。
　　Western Blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，Aβ25-35損傷組p-JAK

20、2、p-STAT3的表達(dá)量顯著升高，分別升高347％和62.5％(P＜0.05);與Aβ25-35組比較，孕酮保護(hù)組p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05);與Aβ25-35+孕酮組比較，AG-490處理組p-JAK2、p-STAT3表達(dá)量降低(P＜0.05);其中各組t-JAK2、t-STAT3未見(jiàn)顯著改變(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、體外條件下，采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法可從大鼠海馬組織中分離培養(yǎng)

21、出神經(jīng)干細(xì)胞。去除培養(yǎng)基中bFGF、EGF，添加10％FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2、Aβ25-35在體外能濃度依賴(lài)的抑制NSCs增殖，抑制NSCs分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3、孕酮濃度依賴(lài)的加重Aβ25-35對(duì)NSCs增殖的抑制作用;促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　4、孕酮可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮上述促分化作用，且孕酮膜受體為其作用靶點(diǎn)