人臍血間充質干細胞定向分化為神經細胞及基因修飾的實驗研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血腦損傷(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)是新生兒期腦損傷最為常見的疾病，是引起新生兒死亡、影響新生兒正常發(fā)育、導致兒童腦癱、精神發(fā)育遲滯、學習障礙和癲癇等神經系統(tǒng)傷殘的主要原因。本病發(fā)病率較高，推測國內每年約有750000新生兒發(fā)生窒息，約有25萬嬰兒因而成為傷殘兒和/或低智兒童(韓玉昆，1995)。盡管圍產醫(yī)學和對HIBD發(fā)病機制研究均取得很大發(fā)展，臨床上仍以對癥支持綜合治療為主而缺少特

2、異性的有效手段。因此為新生兒缺氧缺血腦損傷尋找新的治療途徑十分必要。 細胞移植和基因治療已成為治療中樞神經系統(tǒng)損傷和退行性變的最有潛力的手段之一。然而這兩種治療方法目前仍存在許多有待解決的問題。傳統(tǒng)的細胞移植物來源于人的胎腦、胚胎神經組織和神經干細胞，這些移植物雖然可以定向分化為各類神經細胞而發(fā)揮替代作用，但因取材困難、涉及倫理學爭議及免疫排斥等問題限制了應用的空間(Bjorklund，2000)?；蛑委煹囊恍┹d體如腺病毒、逆

3、轉錄病毒、桿狀病毒也同樣存在使用的安全性、免疫排斥等問題(Somia，2001)。因此，選用何種細胞做為移植來源和基因載體是能否用于臨床的關鍵所在。 間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，起源于中胚層，主要位于成體骨髓，在臍血和外周血中也有少量的MSCs存在(Erice，2000；Goodwin，2004；Jeong，2004；Fernandez，1997)。MSCs具有強大的增殖能力，在體外長期培

4、養(yǎng)過程中可以始終保持其多向分化潛能，在特定條件誘導下可以分化為各種組織細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、成肌腱、成肌細胞、脂肪細胞和神經細胞(Owen,1998；Young，1998；Wakitani，1995；Dennis，1996；Azizi，1998；Kopen，1999；Sanchez-Ramos，2000；Brazelton，2000；Woodbury,2000)。已有實驗證實，MSCs體內移植可以有效改善腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷或帕

5、金森病腦損傷等大鼠模型的神經功能(Chen，2000；Chen，2001；LiY,2001；MahmoodA，2001；許予明，2004)。MSCs用于移植具有以下的優(yōu)點：①具有貼壁生長的特性易于在體外分離和擴增；具有強大的增殖能力，足以滿足移植的需要；在適宜的條件下MSCs可在體外傳25代。1ml骨髓吸取物經傳代后可產生幾十億個MSC(Colter，2000)。②可在體內外表達多種治療性的外源目的基因(Chen，2000；HoCY，2

6、005)，被認為是一種理想的基因治療中的靶細胞。③可以進行自體移植，避免了免疫排斥問題。④除局部定位移植外，還可進行系統(tǒng)移植如經靜脈輸注(Li,2001；Yukinori，2002；Chen2001)，此移植方式便于今后應用于臨床。 然而，取材于骨髓的MSCs同時也存在著應用上的局限性：首先，骨髓MSCs的取材對供者仍可造成一定的損傷；其次，個體骨髓容易受到病原的侵襲尤其是皰疹病毒的感染；再次，隨年齡增長骨髓細胞數量及其增殖和分

7、化潛能下降(D'Ippolito，1999；Rao，2001)等。因此，尋找新的MSCs來源很有必要。與人骨髓和外周血相比，源于臍血的間充質干細胞(umbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，UCB-MSCs)所具備的來源豐富、易獲性、無創(chuàng)性、較少受病原體侵襲、可用于凍存等優(yōu)點，使其在近年來逐漸受到研究者的重視。而且，臍血免疫原性相對較弱，其內淋巴細胞相對不成熟(TaylorS，1985；LuL，199

8、6)，還能用于HLA(humanleucocytesantigen，人類白細胞抗原)配型不符者之間輸注(Maitra，2004)。如果源于臍血的MSCs能在體外培養(yǎng)并建系，有望成為臨床上治療中樞神經系統(tǒng)損傷和退行性病變的可行性方法。尤其針對于新生兒HIBD，由于骨髓采集存在一定困難，自體臍血取材的便利性、無創(chuàng)性、實用性等優(yōu)勢顯而易見。 然而迄今為止，對UCB-MSCs的研究目前仍處于初級探索階段，遠不如骨髓MSCs被廣泛研究應用

9、，其主要面臨的問題如下：①UCB-MSCs體外培養(yǎng)困難，從臍血中收獲MSCs的成功率遠低于骨髓，文獻報道均未超過30％(Erices，2000；周敦華，2003；Bieback，2004)，足月兒產率更低為12.5％(Bieback，2004)，而骨髓MSCs一般在60％以上。所以體外培養(yǎng)所碰到的數量少、成功率低是UCB-MSCs用于研究首先面臨的一個重要問題。那么是什么因素影響了UCB-MSCs體外培養(yǎng)的成功率?其原因尚不清楚。②體外

10、誘導UCB-MSCs定向分化為神經元的方法尚不成熟。與之相比，骨髓MSCs的定向誘導則比較成熟。雖然UCB-MSCs和骨髓MSCs兩者在形態(tài)學、生物學性狀和多向分化潛能等方面有很多相似之處。但在向神經細胞定向分化的過程中，不同的誘導方法可能會出現不同的效果，如Jeong(2004)借鑒經典的體外誘導骨髓MSCs分化為神經細胞的兩種方法分別是抗氧化劑的誘導方法和促進胞漿內cAMP升高的誘導方法用于UCB-MSCs，發(fā)現前種方法誘導后可快速

11、獲得神經元樣細胞；而后者幾乎不產生任何誘導效果。因此UCB-MSCs和骨髓MSCs的定向誘導分化方法是不可同日而語的，有必要進一步探討。③提高MSCs體內移植后向神經元方向的分化率為一難題。文獻報道移植后的骨髓MSCs僅有0.5％～1％分化為神經元(LiY2001；LiY2002；ChenJ，2001)，其數量遠遠達不到移植治療的需要。UCB-MSCs在此領域的研究尚為空白。針對于新生兒科領域中的缺氧缺血性腦損傷的選擇性神經元壞死的主要

12、病理特點，設想如能提高MSCs在移植之后定植于腦組織局部經腦內環(huán)境的誘導后細胞中神經元細胞的比例將更有利于發(fā)揮其真正意義上的替代性的治療作用。 綜上所述，本研究三部分實驗目的如下：第一部分從胎齡、臍血采集量、臍血單個核細胞(mononuclearcells，MNCs)含量等數個方面來探討影響UCB-MSCs成功培養(yǎng)的相關因素，并在此基礎上探討其生物學特性，以期提高UCB-MSCs的培養(yǎng)成功率；第二部分尋找一種高效、細胞損傷小、適

13、于UCB-MSCs體外分化為神經細胞的誘導方法。第三部分構建含有neurogenin1(神經元素1，ngn1)真核表達質粒，研究ngn1在模擬的體內環(huán)境中對UCB-MSCs定向分化為神經元的作用，以期提高MSCs體內移植后神經元的分化率。 結論1.可以從臍血中分離獲得MSCs，具有與骨髓MSCs相似的形態(tài)學特征、增殖特征和免疫表型。臍血MNCs接種數量在1.25×108/L以上，可以提高培養(yǎng)的成功率。低胎齡者UCB-MS