HPV16-18、HCMV感染與宮頸癌脫落細胞P73表達的關系的研究.pdf

1、目的： 探討p73基因在宮頸癌中是如何表達的，p73與人乳頭狀瘤病毒、巨細胞病毒感染有無相關性，以及兩種病毒負荷量與宮頸癌的關系，為進一步研究宮頸癌的發(fā)生機制提供依據(jù)。 材料和方法： (1)研究對象：均來自2004.4-2006.2山東大學臨床醫(yī)學院濟南市中心醫(yī)院婦科門診及2005.4-2006.2山東大學臨床醫(yī)學院齊魯醫(yī)院婦科門診。共100例。其中病例組70例，經過陰道鏡下活檢、病理診斷證實的宮頸癌有38例(其

2、中鱗癌29例，腺癌9例，按病理分級G1、G2級18例，G3級20例，按FIGO分期Ⅰ期11例，Ⅱ期、Ⅲ期27例，按淋巴結有無轉移，有轉移14例，無轉移24例，按浸潤深度，淺肌層22例，深肌層16例)、宮頸上皮內瘤樣變(CIN)32例(CIN1有19例，CIN11、CIN111共有13例)，均無其他內科疾患。對照組30例，無慢性宮頸炎病史。對照組與病例組均取其宮頸脫落細胞進行檢測。 (2)方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ

3、-PCR)檢測宮頸脫落細胞人乳頭狀瘤病毒、巨細胞病毒；用免疫組織化學方法檢測p73蛋白在宮頸脫落細胞的表達情況。 FQ-PCR方法：兩種病毒均嚴格按試劑盒說明書的操作步驟進行，先處理宮頸脫落細胞標本，提取DNA，再稀釋定量標準品，進行FQ-PCR擴增。如果Ct值＜30，則試驗結果判為陽性。 免疫組織化學法：采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)法。由宮頸刷收集的宮頸脫落細胞離心及濃縮后涂片(玻片經脫脂、防脫

4、處理)。按試劑盒說明書進行操作。用已知陽性切片做陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。p73陽性表達細胞的細胞核呈棕黃色，隨機計數(shù)5個高倍視野(X400)，不足5個高倍視野者，計數(shù)脫落細胞中全部細胞數(shù)。陽性細胞＜10定為陰性(一)，陽性細胞≥10，定為陽性(+)。 結果： 1.PCR擴增結果：38例宮頸癌，HPV16/18型在宮頸鱗癌、腺癌中陽性率分別為100﹪和66.67﹪，是有顯著性差異的(X2=6.41,P＜0.05

5、。)；而CMV在鱗癌、腺癌中陽性率分別為48.27﹪和44.44﹪，差異無顯著性。 32例CIN中HPV16/18型20例，陽性率62.50﹪，CMV7例，陽性率21.87﹪；30例正常宮頸HPV16/18型5例，陽性率16.67﹪，未檢出CMV陽性。 2.HPV16/18型、CMV兩種病毒感染的負荷量(用-X±s表示)比較：38例宮頸癌中HPV16/18型和CMV的平均拷貝數(shù)分別為28.98×106和2.83×106；

6、32例CIN中兩病毒平均拷貝數(shù)為9.63×106和0.09×106；30例正常宮頸HPV16/18型平均拷貝數(shù)為0.23×106；可見，兩種病毒的平均拷貝數(shù)均隨正常宮頸→CIN→宮頸癌而增加。 3.免疫組織化學結果：38例宮頸癌中p73陽性表達的共有26例，陽性率68.40﹪，與文獻報道一致。按病理分級，G1、G2級的陽性率44.44﹪，G3級的陽性率90.00﹪，X2=7.11,P＜0.05?？梢妏73陽性表達在不同病理分級中

7、是有顯著性差異的。而在其他各類分類方法中差異均無顯著性。32例CIN中p73陽性表達的共有8例，陽性率25.00﹪；30例正常宮頸p73陽性表達的只有1例，陽性率3.33﹪。 4.從總體上看，p73與HPV16/18型、CMV均隨正常宮頸→C1N→宮頸癌陽性率逐漸增高。但只有p73與HPV16/18型在此三組中的陽性表達是有顯著性差異的(P＜0.05)；而CMV陽性率在三組中無顯著性差異(P＞0.05)。 5運用四表格確

8、切概率法分別比較p73與兩種病毒的相關關系：p73與HPV16/18型均為陽性的有26例，均為陰性的有3例，X2=4.04,P＜0.05，二者有相關性；p73與CMV均為陽性的有8例，均為陰性的有9例，X2=0.0004,P＞0.05，無相關性。 結論： 1.HPV16/18型、CMV均與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，HPV16/18型在鱗癌中陽性率甚至達到100﹪，提示宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與HPV16/18型直接相關，高危型H

9、PV是宮頸癌的主要致癌因素[4]，但不是惟一致癌因素[5]，單獨HPV尚不足以引起人正常鱗狀上皮細胞充分惡變.僅達到細胞轉化的“永生化”.即相當于臨床的“癌前”階段，HPV感染的細胞發(fā)生惡變需要其它因子的協(xié)同作用[6]。CMV作為高危型HPV的協(xié)同因子，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中也起著不可忽略的作用。 2.兩種病毒的負荷量隨宮頸病變程度的增高而增高，高負荷量提示病毒不斷復制[7]，造成宮頸的持續(xù)感染。應將病毒檢測作為宮頸癌篩查和診斷的

10、重要手段，以便及早發(fā)現(xiàn)病毒持續(xù)感染的高危人群。 3.p73高表達于宮頸癌中，低分化組明顯高于高分化組，而與組織類型、FIGO分期、淋巴結轉移及浸潤深度無關，與Brooks[8]研究結果一致，提示宮頸癌組織確實存在p73蛋白，其過表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關。Brooks認為宮頸癌組織中p73基因表達增高的原因可能與p73沉默等位基因的表達激活有關。p73基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中可能不起抗癌基因作用，而是作為p53的模擬突變體在細胞內模

11、擬p53分子的功能，從而使p53分子失效，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。 4.p73與HPV16/18型有一定相關性表明二者之間存在著某些關聯(lián)，似乎都在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽略的作用，究竟是HPV16/18型的持續(xù)感染導致了宮頸癌的發(fā)生，而宮頸癌的發(fā)展又導致了p73的高表達；還是p73的高表達導致了HPV16/18型的持續(xù)感染，從而導致了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展呢?其相互作用機制并不明了?？赡芤彩桥c宮頸癌中高危型HPVE6、E7癌蛋白有關。由